小肽测定

发酵大豆蛋白中小肽的测定1、原理：利用三氯醋酸作蛋白质沉淀剂，将发酵大豆蛋白中的蛋白质和肽链较长的肽沉淀，并将其中的短链小肽用酸溶解出来，经过滤、离心、消化、蒸馏，测定其蛋白质含量，并以其占样品粗蛋白质的百分数来表示含量。本方法是参照中华人民共和国轻工行业标准大豆肽粉标准(QB/T2653-2004)基础上修订而来。2、试剂及仪器：1）100ml烧杯；2）10ml，50ml移液管；3）干过滤装置；4）半微量法或全量法粗蛋白质测定的试剂和装置；5）15％三氯醋酸溶液；6）4000转/分钟的离心机。3、方法：准确称取样品6克于100ml烧杯中,准确加入15%三氯乙酸溶液50毫升，混合均匀，静置5分钟，以中速定性滤纸干过滤，弃去少许初始滤液，将滤液转移至离心管，在4000转/分钟下离心10分钟，准确移取其上清液10ml于消化管中，按半微量法（消化后定容至100ml，准确移取其中10ml进行蒸馏）或全量法粗蛋白质测定方法测定其粗蛋白质含量。同时做空白试验、测定样品的粗蛋白质的含量。4、结果与计算：小肽%（半微量法）=（V1－V0）×C×6.25×0.014×10×5÷m×100%÷CP×100%小肽%（全量法）=（V1－V0）×C×6.25×0.014×5÷m×100%÷CP×100%式中：V1--馏出液消耗盐酸标准液的体积，ml；V0--空白试验消耗盐酸标准液的体积，ml；C--盐酸的摩尔浓度，mol/l；6.25×0.014--蛋白质转换系数；m--称取样品质量，ｇ；CP—样品的粗蛋白质含量，%。重复性:A）、每个试样的两个平行样间允许相对偏差为其算术平均值的10%，以其算术平均值上报结果；C）、所得的结果是指小肽占粗蛋白质的百分含量。因其中含有无机氮，测得结果应减去无机氮，见非蛋白氮的测定。测定小肽含量时，是如何区分小肽及游离氨基酸的？饲用小肽产品中，小肽含量是表现小肽产品中是“肽”，而非“原蛋白’’或“游离氨基酸”的一个最重要的技术指标。蛋白质经蛋白酶水解，其水解中间产物为胨、肽等，最终产物为氨基酸，肽产品的总蛋白质含量包括未被水解的蛋白质和所有水解中间产物，如部分水解蛋白、胨、肽及游离氨基酸的总量。小肽的分子量小于2000道尔顿，小肽含量指标反映了产品中小肽的实际含量。肽含量是通过检验产品中酸溶蛋白质和游离氨基酸含量，经计算差值而得。酸溶蛋白质是指能够溶解于15％TCA(三氯乙酸)溶液的可溶性蛋白，测定中除去了未水解的较大分子量的蛋白质，其结果显示出产品中(分子量在2000Dalton以下的)肽的含量。这种方法的测定结果对肽含量的范围比较敏感，一般只能对肽含量大于15％的产品测定有实际意义，对低肽含量的产品，需要继续改造才能比较。比如，把用15％TCA沉淀改成用一定浓度的乙醇溶液沉淀，测量的结果可能有新的变化。超滤膜超滤法是目前测定小肽总含量比较简便的方法，产品溶解后，经初步离心，上清夜分别通过截留分子量为100Dalton与10000Dalton的超滤膜，然后进行氨基酸含量测定，测定结果就是分子量在l00Dalton至10000Dalton的小肽段组分的含量。问：肽的测定方法-目前无国家标准，各位朋友可有好的方法？市场上很多保健品打着小肽含量高的招牌，但因小肽测定暂无国家标准，建议各位同仁，齐心协力，研究出可行的测定小肽的方法。我处现有美国安捷伦HP1100高效液相色谱仪，相用于测定肽类物质，尤其是小肽中的二三肽含量，不知市场上的哪种柱的分离效果好，且测定的小肽含量结果更准确!相关的C18柱品种太多，不知选择哪个品牌，哪种型号，国产或是进口？我的联系方式：0835-85279622889459答：你可以选择Waters的Symmetry300的柱子，比多肽分析专用柱便宜，还可以得到好的分析和分离度。郭玉东张洋张均国摘要小肽一般是指二肽或三肽，小肽饲料就是通过化学或生物方法将本来不适合动物利用的蛋白原料分解，制成含有大量小肽的饲料产品。小肽饲料的营养价值在于小肽的吸收优势和其自身的质量。根据影响小肽营养价值的因素，可以选取小肽的总含量、平均肽链长度、特定小肽的含量、特定氨基酸的含量作为评价小肽饲料营养价值的指标。目前小肽含量的测定方法主要有双缩脲法、福林-酚法、三氯乙酸法、甲醛滴定法、凯氏定氮法、紫外光吸收法、消光系数法、考马斯亮兰法、层析比色法、高效凝胶色谱法、高效液相色谱法和CE-ESI-MS联用法。关键词小肽；营养价值；评价指标中图分类号S816.15TheevaluationmethodfornutritionofsmallpeptidefeedGuoYudong,ZhangYang,ZhangJunguoAbstractGenerally,smallpeptideincludesdepeptideandtripeptide.Smallpeptidefeed,whichcontainsalotofsmallpeptide,isproducedwithbadproteinmaterialbychemicalorbiologicaltechnique.Thenutritionalvalueofsmallpeptidefeedincludesitsadvantageinabsorptionanditsquality.Basedonthefactswhichaffectthesmallpeptidefeed'svalue,wechoosetotalcontentofsmallpeptide,averagepeptidelength(APL),contentofspecialpeptide,andcontentofspecialaminoacideastheindextoevaluatethesmallpeptidefeed.ThemainassaymethodsincludeBiuretmethod,Lowrymethod,trichloroaceticacidmethod,formol-titrationmethod,Kjeldahldeterminationmethod,UVabsorptionSpectrum,extinctioncoefficientmethod,Bradfordmethod,chromatographyandspectrophotometry,HPGC,HPLCandCE-ESI-MS.Keywordssmallpeptide；nuturition；assessmentindex传统的代谢模型认为蛋白质必须水解成氨基酸后才能被吸收利用，饲料中氨基酸比例符合理想蛋白质模型就能获得最大的营养效果。但近些年的研究表明，不同来源的饲料氨基酸利用率存在差异，而且在给动物喂以按理想氨基酸模式配制的纯合日粮或低蛋白质氨基酸平衡日粮时，不能获得最佳生产性能。现代研究认为，蛋白质在动物消化酶作用下的水解终产物大部分是由2个或3个氨基酸残基组成的小肽，它们以完整的形式被吸收进入循环系统而被组织利用。以此理论为基础，很多饲料企业开发了小肽饲料，做为饲料添加剂应用于动物饲料中。但是到目前为止，小肽市场仍十分混乱，小肽产品良莠不齐，这归根结底是由于缺乏小肽营养标准。而科学的营养价值评价方法是营养标准的前提，本文对制定合适的小肽营养价值评价方法进行了一些探索，综述了评价小肽营养价值的指标和测定方法。1小肽和小肽饲料的概念评价小肽饲料的营养价值，首先要对小肽和小肽饲料的概念有一个明确的定义。肽是氨基酸的线性聚合物，含氨基酸残基50个以上的通常称为蛋白质，低于50个氨基酸残基的称为肽。最简单的肽由两个氨基酸残基组成，称为二肽（dipeptide），其中含一个肽键。含3个、4个、5个氨基酸残基的肽分别称为三肽、四肽、五肽。通常把含几个至十几个氨基酸残基的肽链统称为寡肽（oligopeptide），更长的肽链称为多肽（polypeptide）。有的学者把超过12个而不多于20个氨基酸残基的称寡肽，含20个以上氨基酸残基的称为多肽。在动物营养学上一般认为“含2个或3个氨基酸残基的肽为小肽”。小肽饲料是一种功能营养性添加剂，也称为小肽营养素。小肽饲料的产生是基于现代营养学的研究成果。研究者认为，蛋白质在消化道中的消化终产物的大部分往往是小肽而不是游离氨基酸(FAA)。小肽能完整地通过肠粘膜细胞进入体循环。小肽的吸收具有转运速度快、耗能低、载体不易饱和等优点，且各种肽之间转运无竞争性与抑制性。小肽也是组织内氨基酸的重要来源之一，动物组织可以直接利用小肽中的氨基酸合成组织蛋白。根据这些研究结果，可以确定小肽是一种更优质的氮源。于是人们开始研究如何生产小肽饲料。在当前的生产工艺下，小肽饲料就是通过化学或生物方法将本来不适合动物利用的蛋白原料分解，制成的含有大量小肽的饲料产品。现在生产小肽饲料的方法主要有酸解法、酶解法、微生物发酵法三条途径。酸解法通过强酸、强碱的作用分解大分子蛋白为小分子肽，由于强酸、强碱具有腐蚀性,该法会带来大量的污染；酶解法利用酶的定向分解的特性将大分子蛋白分解为小分子肽；微生物发酵法是利用微生物的生化反应将蛋白转化为肽。仅就制备小肽来说还有化学合成法、重组DNA法等，但目前仍不适合商业化生产。目前市场上很多小肽饲料并不符合小肽的定义，简单地把寡肽甚至分子量较小的多肽称为小肽，这样做忽略了小肽和寡肽、多肽的区别。肽链的长度是影响肽吸收的原因之一，肽转运主要限于二肽、三肽,对长链肽大量转运的可能性很小，这样的饲料产品其实并不具有小肽在吸收方面的特点。2影响小肽饲料营养价值的因素作为一种饲料产品，小肽饲料的营养价值一方面在于小肽在吸收方面相对于FAA的巨大优势，另一方面取决于饲料本身的质量。2.1影响小肽吸收的因素2.1.1肽链的长度目前的研究认为，二肽和三肽能被完整的吸收，但三肽以上的寡肽是否能完整吸收还有争议。Grimble等报道，肠道对大于三肽的寡肽吸收慢于小肽，肠道内胰蛋白酶、肽酶对其进一步水解可能是寡肽吸收的主要限速反应。当蛋白质水解产物中的寡肽和FAA所占比例较高时，寡肽能诱导肠肽酶的分泌，在肠肽酶的进一步作用下水解释放出FAA，使FAA的浓度提高，从而加剧FAA吸收的竞争抑制，进一步减慢肽的吸收速率。但是，反刍动物瘤胃细菌对大分子肽的摄取速度比小分子肽和氨基酸摄取速度快，且利用效率更高，虽然细菌对低分子量的蛋白质降解产物（小分子量的肽和氨基酸）发酵较快，但大分子肽更容易转化为菌体蛋白质。2.1.2肽的氨基酸残基组成肽的氨基酸残基组成是影响肽吸收的另一个重要因素。当赖氨酸(Lys)与甘氨酸(Gly)形成二肽时，Lys处于N端比处于C端吸收得更快；而Lys与谷氨酸(Glu)形成二肽时，Lys处于C端时吸收更为迅速。L型小肽比D型小肽更易被动物吸收，中性小肽比酸、碱性小肽更易被动物吸收。当肽是由疏水性且体积较大的底物如Met和Phe构成时，载体对肽就有较高的亲合力，因而转运速度较快；而亲水性且带电荷的小肽，载体对其亲合力较小，所以转运速度较慢。乐国伟等研究发现，含疏水性的苯丙氨酸的肽类对肽载体的亲和力高，以肽形式吸收可能是苯丙氨酸吸收本身的需要。Broderick等研究了混合瘤胃微生物对中性肽的代谢，发现含有3个丙氨酸残基的肽代谢最快，其次是Leu(Gly)2、Gly(Ala)2，然后是其它中性三肽、二肽代谢速度相似，但Gly-Pro较慢，(Ala)2代谢较Gly-Pro快；在由丙氨酸残基构成的肽中，三肽代谢速度大于四肽，然后是五肽，二肽最慢。由此可见，肽链的氨基酸序列对肽的利用率也有影响。通过研究Lys-Pro肽、Lys-Ala肽、Met-Ala肽的效应发现，前两种肽的代谢速度比后一种肽慢4倍。2.1.3肽的来源程茂基等通过体外培养发现，反刍动物对瘤胃液肽的摄取量和摄取率显著高于大豆肽（P0.05）和玉米肽(P0.05)，表明肽来源不同能影响其吸收和利用。2.2决定小肽饲料质量的因素2.2.1小肽饲料中小肽的含量小肽是小肽饲料中的有效成分。不同生产工艺下小肽饲料中小肽的含量是不同的，小肽含量的高低