灵芝多糖拮抗前列腺素E2对小鼠脾细胞IFN-γ和TNF-α

灵芝多糖拮抗前列腺素E2对小鼠脾细胞IFN-γ和TNF-αmRNA表达的抑制作用作者：张群；雷林生；朱正光；余传林；吴曙光(南方医科大学药学院药物研究所，广东广州510515)摘要：目的观察灵芝多糖拮抗前列腺素E2(PGE2)对小鼠脾细胞干扰素γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)mRNA表达的抑制作用。方法混合淋巴细胞培养反应作为实验模型，半定量RT-PCR方法检测IFN-γ和TNF-αmRNA的表达水平。结果PGE2连续作用4h后，脾细胞IFN-γmRNA的表达与对照组比较受到不同程度的抑制，当PGE2浓度在10μmol/L以上时具有统计学意义(P0.01)。固定PGE2浓度为20μmol/L，合用不同浓度的灵芝多糖，当灵芝多糖为100mg/L以上时可部分对抗PGE2的抑制作用。培养8h后，PGE2明显抑制TNF-αmRNA的表达，灵芝多糖为100mg/L以上时可部分对抗。结论灵芝多糖可部分拮抗PGE2对小鼠脾细胞IFN-γ和TNF-αmRNA表达的抑制作用。关键词：灵芝多糖；前列腺素E2；干扰素γ；肿瘤坏死因子α；mRNA中图分类号：R979.1；R979.5文献标识码：A文章编号：1673-4254(2006)06-0780-04GanodermapolysaccharidesantagonizeprostaglandinE2-inducedsuppressionofmurinesplenocyteIFN-γandTNF-αmRNAexpressionZHANGQun；LEILin-sheng；ZHUZheng-guang；YUChuan-lin；WUShu-guangInstituteofPharmaceuticalSciences,SchoolofPharmaceuticalSciences,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,ChinaAbstract:ObjectiveTodetermineifGanodermapolysaccharidescanantagonizeprostaglandinE2(PGE2)-inducedsuppressionofmurinesplenocyteinterferonγ(IFN-γ)andtumornecrosisfactorα(TNF-α)mRNAexpression.MethodsMixedlymphocyteculturereactionwasusedastheexperimentalmodel.TheexpressionslevelsofIFN-γandTNF-αmRNAweremeasuredbysemi-quantitativereversetranscriptase-polymerasechainreaction(RT-PCR).ResultsAftertheculturesweretreatedwithPGE2for4h,IFN-γmRNAexpressionwasreducedascomparedwiththecontrol,whichwasespeciallyobviouswhenPGE2concentrationsexceeded10μmol/L(P0.01).Ganodermapolysaccharidesabove100mg/LshowedpartialantagonisticeffectagainsttheinhibitionofIFN-γbyPGE2atthefixedconcentrationof20μmol/L.FurtherstudiesindicatedthatPGE2(20μmol/L)impairedtheexpressionofTNF-αmRNAafteran8-hourincubationandGanodermapolysaccharidesabove100mg/Lcouldpartiallyantagonizethiseffect.ConclusionGanodermapolysaccharidescanpartiallyantagonizePGE2-inducedsuppressionofmurinesplenocKeywords:Ganodermapolysaccharide;prostaglandinE2;interferonγ;tumornecrosisfactorα;mRNA收稿日期：2005-11-07基金项目：广东省自然科学基金(04020361)SponsoredbyNaturalScienceFoundationofGuangdongProvince(04020361)作者简介：张群(1979-)，女,在读硕士研究生，电话：[phone]，E-mail:[e-mail]通讯作者：雷林生(1960-)，男，博士，博士生导师，教授，电话：[phone]，E-mail:[e-mail]灵芝[Ganodermalucidum(LeyssexFr.Karst.)]是灵芝菌科灵芝属真菌。化学分析表明灵芝含有多种生物活性成分，如多糖类、核苷类、多肽类、三萜类等。其中，多糖是灵芝中主要的生物活性成分之一。研究报道，灵芝多糖具有增强免疫功能和抗肿瘤作用[1][2][3]，但其抗肿瘤作用的机制却不十分清楚。肿瘤逃避免疫监视的机制比较复杂，其中之一是有些肿瘤细胞能分泌前列腺素E2(PGE2)[4][5]，后者对免疫系统产生广泛的抑制作用，肿瘤得以逃避免疫系统的攻击，在体内无限生长。本研究的目的是观察灵芝多糖能否拮抗PGE2对小鼠脾细胞干扰素γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)mRNA表达的抑制作用，探讨灵芝多糖在免疫方面的抗肿瘤机理。1材料和方法1.1材料1.1.1动物C57BL/6j(批号：2004A065)及BALB/c(批号：2004A066)小鼠(SPF级)，8至10周龄，雌雄兼用，购自南方医科大学实验动物中心。1.1.2药品与试剂RPMI1640培养基(GIBCO公司产品)，新生牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司产品)，HEPES(MDBio，分装)。DEPC、PGE2均为Sigma产品。RNAoutTM(深圳市华氏生物技术有限公司产品)。傻瓜RT反应体系(AccuPowerRTPreMix，内含逆转录酶、dNTPs、RNA酶抑制剂、缓冲剂等)，傻瓜PCR反应体系(PCRPreMix，内含TagDNA聚合酶、dNTPs、PCR增强剂、缓冲剂、上样染料及稳定剂)，均购自赛百盛公司。oligod(T)18(TaKaRa产品)，琼脂糖(BiowestAgarose，上海YITO生物器材企业有限公司分销)，溴化乙锭(EB，上海博彩生物工程公司产品)。灵芝多糖参照文献[6]方法提取，为多糖组分，呈浅棕色，易溶于水，相对分子质量7000～9000。其余化学试剂均为分析纯。1.1.3仪器CO2培养箱(美国FormaScientific公司)，AB-120型电子分析天平(美国DenverInstrument公司)，台式低温高速离心机(Bechman公司)，PCR循环仪(PTC-100TM，美国MJResearchInc.公司)，电泳仪(PowerPAL3000，Bio-RAD公司)，凝胶成像分析系统(摄像暗箱：TFP-M/ML；分析软件：Bio-CAPTv.97；法国EtsVILBERLOURMAT公司)。1.2方法1.2.1细胞培养以混合淋巴细胞培养反应作为实验模型，具体操作参照文献[7]。无菌分离C57BL/6j及BALB/c小鼠脾细胞，1∶1混合，用含10%新生牛血清的RPMI1640培养基接种于96孔板中，细胞密度为每孔8×105个，另加实验药品，总体积为200μl。于37℃、含5%CO2饱和水蒸气的孵箱中根据实验不同培养所需的时间，检测IFN-γmRNA表达时为4h，检测TNF-αmRNA表达时为8h。1.2.2实验方案为了确定合适的PGE2浓度作为抑制模型，首先研究PGE2抑制IFN-γmRNA表达的量效关系。设4个PGE2浓度组，分别为5、10、20、40μmol/L，对照组加等体积的培养液，得半效抑制浓度约为20μmol/L。然后固定PGE2浓度为20μmol/L，在其中再加入不同浓度的灵芝多糖(100、200mg/L)，观察灵芝多糖拮抗PGE2对IFN-γ或TNF-αmRNA表达的抑制作用，共设5组，即：空白对照组(加等体积培养液)，灵芝多糖(200mg/L)促进表达组，PGE2(20μmol/L)抑制表达组，PGE2(20μmol/L)+灵芝多糖(100mg/L)组，PGE2(20μmol)+灵芝多糖(200mg/L)组。1.2.3总RNA提取根据厂家说明书所提供的方案按比例缩小进行操作。细胞在培养4h(检测IFN-γmRNA)或8h(检测TNF-αmRNA)后，先吸弃96孔板中的培养液，然后，每孔加RNAoutTM试剂40μl，每组收集10孔裂解液于1mlEppendorf管中，提取总RNA。1.2.4逆转录反应先将DEPC处理水配制的oligodT18(10nmol/L)与DEPC处理水配制的总RNA(0.1mg/L)按体积比1∶1混合于Eppendorf管中，70℃孵育5min，4℃冷却2min。吸取上述混合液20μl加入AccuPowerRTPreMix管中，振荡混匀，快速离心数秒，置PCR循环仪中反应。反应参数如下：42℃逆转录反应60min，然后94℃终止反应5min。1.2.5PCR扩增PCR引物采用在线软件Primer3进行设计。小鼠IFN-γ上游引物：5'-tttgaggtcaacaacccaca-3'，下游引物：5'-cgcaatcacagtcttggcta-3'，PCR扩增产物为388bp。小鼠TNF-α上游引物：5'-agtccgggcaggtctacttt-3'，下游引物：5'-gcacctcagggaagagtctg-3'，PCR扩增产物为422bp。小鼠β-actin上游引物：5'-ccagagcaagagaggtatcc-3'，下游引物：5'-ggggtgttgaaggtctcaaa-3'，PCR扩增产物为216bp。PCR操作如下：在PCRPreMix管中加入消毒双蒸水8μl，被检测基因mRNA逆转录产物或内参β-actinmRNA逆转录产物2μl，相应的上、下游引物各5μl(15pmol)，振荡混匀，加石蜡油15μl，快速离心数秒，置PCR循环仪中反应。反应参数如下：94℃预变性2.5min，然后进入以下28个循环：94℃变性45s，57℃退火1min，72℃延伸1.5min。循环完毕，72℃延伸5min。1.2.6半定量分析取被检测基因和β-actinRT-PCR扩增产物上样于2%琼脂糖凝胶(含EB0.05%)梳孔中，采用0.5×TBE电泳缓冲液，在3v/cm电压条件下电泳50min。将凝胶转移至凝胶分析系统暗箱中，在紫外线照射下测定PCR扩增产物的荧光强度值。结果表示为：(被检测基因扩增产物荧光强度值÷相应β-actin扩增产物荧光强度值)×100%。1.3统计学处理组间显著性差异采用配对资料的t检验。2结果2.1PGE2对混合淋巴细胞培养反应(MLR)中IFN-γmRNA表达的抑制作用不同浓度PGE2连续作用4h后，MLR中小鼠脾细胞IFN-γmRNA表达受到不同程度的抑制，随着PGE2浓度的增加，抑制作用不断增强。PGE2浓度在10μmol/L以上时与空白对照组比较，其抑制作用具有统计学意义(P0.01，n=5，图1)，半效抑制浓度约为20μmol/L。因此，选择20μmol/L的PGE2作为抑制模型的造模浓度。2.2灵芝多糖拮抗PGE2对MLR中脾细胞IFN-γmRNA表达的抑制作用在MLR中，固定PGE2浓度为20μmol/L，在其中再加入不同浓度的灵芝多糖(100或200mg/L)，观察灵芝多糖对PGE2的拮抗作用。培养4h后，灵芝多