色层分离法

色层分离法概述历史1906年俄国植物学家MichaelTswett首次发现层析法色谱法层离法石油醚色层分离的基本原理色层系统组成固定相流动相固定不动的物质称作固定相(固体或液体)推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体利用混合物中各组分物理化学性质的差异使各组分在两相中的分布程度不同，从而使各组分以不同的速度移动而达到分离的目的。吸附力分子形状及大小分子亲和力分配系数色层分离的基本原理性质色层分离法基本原理层析分离分类按溶质分子与固定相相互作用机理①吸附层析（范德华力，氢键，静电力，共价力）②分配层析（溶质在两液相间分配系数不同）③凝胶过滤（分子大小与形状）④亲和层析层析分离分类按操作形式不同分类：①柱层析：②纸层析：③薄层层析：层析分离分类根据流动相分类气相层析液相层析超临界流体层析根据压力分类低压（小于0.5Mpa)中压(0.5-5Mpa)高压(5-40Mpa)色层分离的基本概念迁移距离流动相在色谱系统中的溶质的迁移距离fRcqKd分配系数Kd---分配系数q、c---溶质在固相和液相中的浓度体现某一种溶质与固定相之间的亲和力大小阻滞因素色层分离的基本概念洗脱体积sdmeVKVV色谱柱中，使溶质从柱中流出所需流动相体积不同的溶质，由于和固定相的亲和力的不同，洗脱体积也有所差异色层分离的基本概念两峰之间的距离与两峰宽的平均值之比分离度塔板理论固定液载气迁移平衡固定液载气固定相流动相吸附层析技术原理利用吸附剂对混合试样各组分的吸附力不同而使各组分分离。吸附层析技术氧化铝-O-Si-O-Si-O-HO-H-O-Al-O-Al-O-HO-H-CH2-N-C-CH2-OH应用：有机溶剂中分离天然成分硅胶聚酰胺固定相分配层析技术利用溶质在固定相和流动相之间的分配系数不同而分离的方法固定相载体流动相要素分配层析技术载体：通常为惰性材料，能吸附固定相液体载体种类：硅胶硅藻土纤维素葡聚糖凝胶30µm15µm5µm分配层析技术固定相C-18、C-8烷基链流动相正相分配层析反相分配层析水、稀硫酸、甲醇极性溶剂非极性溶剂凝胶层析法基本原理分子通过装有凝胶颗粒的层析柱时，根据它们分子大小不同而进行分离的技术。凝胶层析法凝胶层析法凝胶层析法优点：操作简便分离效果好，重复性高，回收率高分离条件温和应用广泛适用于生物大分子的初级分离，脱盐缺点：处理量小稀释凝胶理化性质排阻极限是指不能扩散到凝胶基质内部中去的最小分子的分子量分级范围指当溶液通过凝胶柱时,能够为介质阻滞并且分离的溶质分子量范围床体积表示1g干胶在溶胀后所具有的最后体积空隙体积表示填充柱中凝胶粒子周围的总空间凝胶理化性质粒度：操作粗(相当于50目)中(100目)细(200目)极细(300目)溶胀装柱加样洗脱凝胶层析法LogMABCLogM测V测蛋白质通过凝胶柱的速度即洗脱体积与其分子量有关LogM=k1-k2Ve凝胶层析法凝胶的种类和性质交联葡聚糖凝胶（Sephadex)葡萄糖分子间主要是α-1,6-糖苷键交联剂：1-氯-2，3-环氧丙烷品名干胶颗粒直径/μm得水值Wf/g.g-1床体积/mL.g-1最适分段分离范围溶胀所需时间/h最大流体静力压/Pa(cmH2O)球蛋白分子质量／Da线性葡聚糖分子质量/Da20℃lOO℃SephadexG-1O40-1201.0±0.12-3700700319810(100)SephadexG-1540-1201.5±0.22.5-3.515001500319810(100)SephadexG-25粗中粗细超细100-30050-15020-8010-402.5±0.24-61000-5000100-5000629810(100)SephadexG-50粗中粗细超细100-30050-15020-8010-405.0±0.39-111500-30000500-10000629810(100)SephadexG-75中粗超细40-12010-407.5±0.512-153000-700001000-500002434905(50)SephdexG-100中粗超细40-12010-4010±l.015-204000-1500001000-1000004853434(35)SephadexG-150中粗超细40-12010-4015±1.520-305000-4000001000-1500007251472(15)SephadexG-200中粗超细40-12010-4020±2.030-405000-8000001000-200000725981(10)凝胶层析法琼脂糖凝胶β-D-吡喃半乳糖3，6脱水-L-吡喃半乳糖凝胶层析法琼脂糖凝胶β-D-吡喃半乳糖+3，6-脱水-L-吡喃半乳糖聚合离子交换层析原理以离子交换剂作为固定相，选择合适的溶剂作为流动相，使溶质按照其离子交换亲合力的不同而得到分离的方法阳离子交换层析过程离子交换树脂蛋白质高离子强度洗脱液洗高离子强度洗脱液洗加样平衡液洗收集离子交换层析一CH2SO3H活性基团一SO3H-COOH-OH(酚羟基）离子交换层析二乙基胺乙基活性基团常用的离子交换剂葡聚糖凝胶型Sephadex纤维素系列离子交换剂SephacelCellex系列琼脂糖系列离子交换剂Sepharose系列SepharoseCL-6B,离子交换层析12346789105pHpHpI（+）pH=pI（0）pHpI（-）吸附阳离子交换剂吸附阴离子交换剂等电点蛋白质净电荷+-离子交换介质的选择原则离子交换层析样品洗脱102030405060708090恒定洗脱阶段洗脱梯度洗脱离子强度pH值离子交换层析疏水作用层析在载体表面连接疏水基团，可以与蛋白质的某些疏水基团相互作用，从而实现多组分的分离。疏水性分离依据疏水作用层析吸附剂：配体：苯基C6，辛基C8，烷基C18介质：硅胶、树脂如phenyl、sepharoseFF、sepharoseCL-4B（1）Pr表面的疏水补丁。（2）Pr局部变性，暴露疏残基。（3）高盐浓度下Pr表面疏水表面与固定相结合。1mol/L(NH4)2SO4,2mol/LNaCl,原理：A2800.04AU疏水层析操作利用待分离物质与其特异性配体之间特异性的亲和力进行分离的一类特殊的层析技术亲和层析纯化过程简单、迅速，且分离效率高特别适用于分离纯化一些含量低、稳定性差的生物大分子纯化倍数大，产物纯度高应用范围受限特点配体蛋白质蛋白质和配体复合物交联试剂载体配体载体与配体交联体杂质杂质游离配体亲和层析具有特异性亲和作用的生物分子抗原与抗体DNA与互补DNA或RNA激素或药物与其受体糖蛋白与其相应的植物凝集素亲和层析葡聚糖凝胶纤维素琼脂糖凝胶其它新型载体聚丙烯酰胺凝胶常用的亲和层析载体亲和层析配基的选择条件就要强烈，这样可能使生物分子变性配基必须具有适当的化学基团，这种基团不参与配基与生物分子之间特异结合，但可用于和载体相连，同时又不影响配基与生物分子之间的亲和力纯化对象和配基之间必须有较强的亲和力但亲和力太高也是有害的，因为在解离配基复合物时所需的蛋白质分离常用的色谱方法免疫亲和层析属于吸附色谱中的一种，利用抗原-抗体作用的高度专一性以及较强的吸附力，实现特殊蛋白质的分离免疫亲和层析介质的获得：（1）获得抗体（2）抗体连接到载体上