色谱法导论

色谱法导论色谱法概述色谱理论基础色谱定性、定量方法概念起源分类色谱流出曲线及术语色谱分离原理色谱法概述色谱法的起源•1906年，俄国植物学家茨维特把植物叶子的色素混合液加在如右图的装置中(玻璃管中装有碳酸钙)，然后让石油醚不断自上而下流过，随着过程的进行，开始混为一体的混合物分离为不同颜色的清晰色带，因此得名色谱法；•经典色谱法不能实现分离与分析的连续进行。MichaelTswett(1872-1919),aRussianbotanist,discoveredthebasicprinciplesofcolumnchromatography.Heseparatedplantpigmentsbyelutingamixtureofthepigmentsonacolumnofcalciumcarbonate.Thevariouspigmentsseparatedintocoloredbands;hencethenamechromatography.•后来不仅用于分离有色物质，还用于分离无色物质，并出现了种类繁多的各种色谱法。•但不管属于哪一类色谱法，其共同的基本特点是具备两个相：不动的一相称为固定相；另一相是携带样品流过固定相的流体，称为流动相。不同组分在色谱柱内滞留时间长短不同，从而按先后不同的次序从色谱柱中流出。色谱法的发展•在色谱发展史上占有重要地位的英国人A.J.P.Martin(马丁)和R.L.M.Synge(辛格)。•他们提出色谱塔板理论；发明液-液分配色谱；预言了气体可作为流动相（即气相色谱）；1952年，因为他们对分配色谱理论的贡献获诺贝尔化学奖。色谱法的发展历史年代发明者发明的色谱方法或重要应用1906Tswett用碳酸钙作吸附剂分离植物色素。最先提出色谱概念。1931Kuhn,Lederer用氧化铝和碳酸钙分离a-、b-和g-胡萝卜素。使色谱法开始为人们所重视。1938Izmailov,Shraiber最先使用薄层色谱法。1938Taylor,Uray用离子交换色谱法分离了锂和钾的同位素。1941Martin,Synge提出色谱塔板理论；发明液-液分配色谱；预言了气体可作为流动相（即气相色谱）。1944Consden等发明了纸色谱。1949Macllean在氧化铝中加入淀粉黏合剂制作薄层板使薄层色谱进入实用阶段。1952Martin,James从理论和实践方面完善了气-液分配色谱法。1956VanDeemter等提出色谱速率理论，并应用于气相色谱。1957基于离子交换色谱的氨基酸分析专用仪器问世。1958Golay发明毛细管柱气相色谱。1959Porath,Flodin发表凝胶过滤色谱的报告。1964Moore发明凝胶渗透色谱。1965Giddings发展了色谱理论，为色谱学的发展奠定了理论基础。1975Small发明了以离子交换剂为固定相、强电解质为流动相，采用抑制型电导检测的新型离子色谱法。1981Jorgenson等创立了毛细管电泳法。色谱法起过关键作用的诺贝尔奖研究工作年代获奖学科获奖研究工作1937化学类胡萝卜素化学，维生素A和B1938化学类胡萝卜素化学1939化学聚甲烯和高萜烯化学1950生理学、医学性激素化学及其分离、肾皮素化学及其分离1951化学超铀元素的发现1955化学脑下腺激素的研究和第一次合成聚肽激素1958化学胰岛素的结构1961化学光合作用时发生的化学反应的确认1970生理学、医学关于神经元触处迁移物质的研究1970化学糖核苷酸的发现及其在生物合成碳水化合物中的作用1972化学核糖核酸化学酶结构的研究1972生理学、医学抗体结构的研究现代色谱法•现代色谱实现了分离与检测的连续进行。色谱法的特点•色谱法是一种可将分离与分析连续进行的分离技术，与其它传统的分离方法比，它的分离效率高，分析速度快，检测灵敏度高，样品用量少，选择性好，可进行多组分同时分析，易于自动化。•缺点是定性能力较差。色谱法的分类•按色谱动力学过程分•按两相的状态分•按分离原理分•按固定相形态分按色谱动力学过程分•淋洗色谱法•置换色谱法•迎头色谱法按两相状态分按流动相状态分气相色谱法液相色谱法按固定相状态分气固色谱气液色谱按固定相状态分液固色谱液液色谱其中，气固和液固色谱中的固定相是一种多孔的、具有较大表面积的吸附剂颗粒这种固定相与组分间存在物理吸附作用；气液和液液色谱中的固定相是在具有化学惰性的固体颗粒（称担体）表面涂敷一层高沸点有机化合物的液膜，称之为固定液，它能够溶解组分。超临界流体色谱按固定相形态分柱色谱：固定相装于柱内填充柱色谱：将固定相装于金属或玻璃管中开管柱色谱（或称毛细管柱）：将固定液均匀涂敷在毛细管内壁平板色谱：固定相呈平面状纸色谱：以滤纸为固定相薄层色谱：将吸附剂粉末制成薄层作固定相按分离原理分色谱法名称分离原理吸附色谱分配色谱离子交换色谱排阻色谱亲和色谱各组分与固定相间的吸附能力不同各组分与固定液中的溶解度不同各组分与固定相间的静电作用力不同固定相(多孔物)对大小分子的选择性排阻组分分子与固定相之间有无特异性结合力其它色谱方法•毛细管电泳是一种将毛细管色谱柱与电泳结合在一起形成的新型的分离技术，九十年代得到快速发展，尤其适用于生物大分子的分离分析。•制备色谱•色谱联用技术色谱流出曲线及术语•色谱图及色谱流出曲线即色谱色谱图,也称色谱峰。如下图所示•理想的色谱流出曲线应呈正态分布。色谱流出曲线与术语1.基线和峰高h无试样通过检测器时，检测到的信号即为基线；峰高h为色谱峰顶到基线的垂直距离。2.保留值（1）时间表示的保留值死时间（tM）：不与固定相作用的组分（如空气）的保留时间；保留时间（tR）：组分从进样到柱后出现浓度极大值时所需的时间；调整保留时间（tR＇）：tR＇=tR－tM（2）用体积表示的保留值死体积（VM）：VM=tM×Fc;Fc为柱出口处的流动相流量(单位：mL/min)。保留体积（VR）：VR=tR×F0调整保留体积(VR＇)：VR＇=VR－VM（3）相对保留值α相对保留值只与固定相性质与柱温有关，可用作组分的定性分析；数值大小体现了柱选择性的好坏,α值越大,则柱选择性越好,两组分分离得越开；当α等于1时，两组份重叠,不能分开.)()()()()()(AKBKAkBkAtBtRR色谱流动相流速•色谱流动相的流速通常有两种度量方式。•体积流量（Fc）：是单位时间流过色谱柱的平均体积，单位mL·min-1。不同的色谱法Fc的测量方法不同。•线速度（u）：定义为单位时间内流动相流经色谱柱的长度，单位cm·min-1，实际应用中，可用柱长L和死时间tM求出。MtLu3.区域宽度（色谱峰的宽度）色谱法中区域宽度是一个很重要的参数,因为区域宽度的大小反映了柱效的好坏。用来衡量色谱峰宽度的参数有三种：（1）标准偏差()：即0.607倍峰高处色谱峰宽度的一半。（2）半峰宽(Y1/2)：色谱峰高一半处的宽度Y1/2=2.354（3）峰底宽(Wb)：Wb=4•理想的色谱峰呈正态分布,其数学表达式为(组分的浓度随时间的变化情况)：•式中c为不同时间t时某物质的浓度，c0为进样浓度，tR为保留时间，σ为标准偏差。4.色谱流出曲线的数学描述222)(0π2σσttRecc5.根据色谱流出曲线可以得到的信息•根据色谱峰的个数,可判断样品中至少有几个组分;•根据保留值,进行定性分析;•根据曲线面积或峰高,可进行定量分析;•根据保留值及区域宽度,可对色谱柱的分离效能做出评价;色谱分离原理•色谱分析的目的是将样品中各组分彼此分离。•组分要达到完全分离，两峰间的距离必须足够远，两峰间的距离是由组分在两相间的分配系数决定的，即与色谱过程的热力学性质有关。•但是两峰间虽有一定距离，如果每个峰都很宽，以致彼此重叠，还是不能分开。这些峰的宽或窄是由组分在色谱柱中传质和扩散行为决定的，即与色谱过程的动力学性质有关。•因此，要从热力学和动力学两方面来研究色谱行为。1.色谱分离过程当混合组分A+B由流动相携带进入色谱柱与固定相接触时,组分即被固定相溶解或吸附;随着流动相的不断加入,被溶解或吸附的组分又从固定相中挥发或脱附;挥发或脱附下的组分随着流动相向前移动时又被固定相再次溶解或吸附;随着固定相的流动,组分在两相之间进行着反复的吸附-脱附或溶解-挥发过程；但由于组分A和B的结构性质不同,则二者与固定相之间作用力大小也不同；A由于与固定相作用力较小,使得每一个脱附过程均较B快一些,因而先从色谱柱中流出,实现了分离。2.分配系数•组分在固定相和流动相间发生的吸附-脱附(或溶解-挥发)的过程叫做分配过程;•在一定温度、压力下，组分在两相间分配达到平衡时的浓度比是一个常数，称为分配系数，用K表示；•温度一定，则分配系数小的组分先流出，且两组分的K值之比越大，则分离效果越好。MsccK组分在流动相中的浓度组分在固定相中的浓度3.分配比•也称容量因子、容量比；•指在一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的物质的量的比，用k表示：•组分的分配比可通过色谱曲线测得Msnnk组分在流动相中的质量组分在固定相中的质量4.分配系数与分配比的定量关系KVVccVVMVVMMMkmSmsmmSSSSmS•β为相比,填充柱相比：6～35；毛细管柱的相比：50～1500;•Vm为死体积,即柱内固定相颗粒间的空隙体积；VS为固定相体积,它指真正参与分配的那部分体积,如固定液体积、吸附剂表面积及凝胶孔容等。5.分配系数与分配比的说明•色谱的分离过程是一个复杂的过程,由体系的热力学因素和动力学因素综合作用的结果;•分配系数与分配比都是与组分及固定相的热力学性质有关的常数,随柱温、柱压的改变而变化;•分配系数与分配比都是衡量色谱柱对组分保留能力的参数,数值越大,该组分的保留时间越长;•分配系数只取决于组分与两相性质,与体积无关;分配比还与两相的体积有关.色谱理论基础塔板理论速率理论分离度塔板理论及其贡献•塔板理论把色谱柱类比为精馏塔,沿用精馏塔中的塔板概念和方法来处理色谱分离过程.•引入了理论塔板数作为分离柱效率(简称柱效)的衡量指标.•成功解释了流出曲线的形状(呈正态分布).•论证了保留值与分配比的关系。MRttk'塔板理论的主要内容（假设）•虚拟塔板将色谱柱分成多个小段,在每一小段内,组分在两相内可快速达到分配平衡,并把这一段柱长称为理论塔板高度H；•流动相进入柱内不是连续而是脉动式的，每次注入的体积称为一个板体积ΔV；•试样开始时都加在第0号塔板中，忽略塔板之间的纵向分子扩散；•分配系数在每一块板上均为常数，与组分在某一塔板上的量无关。nLH塔板理论的分离过程•为简单起见,设色谱柱由5块塔板（n＝5,n为色谱柱的塔板数）组成,并以r表示塔板编号,r=1，2…，n－l,某组分(k=1,m=1)为试样.•开始时,该组分加到第0号塔板上,分配平衡后,由于k=1,即ms=mm故mm=ms=0.5;•当一个板体积（lΔV）的载气以脉动形式进入0号板时,就将气相中含有mm部分组分的载气顶到1号板上,此时0号板液相（或固相）中ms部分组分及1号板气相中的mm部分组分，将各自在两相间重新分配:故0号板上所含组分总量为0.5,其中气液（或气固）两相各为0.25而1号板上所含总量同样为0.5．气液（或气固）相亦各为0.25。•以此类推,每当一个新的板体积载气以脉动式进入色谱柱时,上述过程就重复一次(见下表)。结论-流出曲线•根据上表中的数据,以加入的流动相的板体积数为横坐标，组分在柱出口处出现的分数x为纵坐标，绘得流出曲线；•曲线呈峰形，但不对称，当n50时，就可得到对称的峰形曲线，且从理论上推导，当n越大(理论塔板数越多)，流出曲线越趋于正态分布；•若试样为混合物，由于组分的分配系数存在差异，因此在经过足够多次的分配平衡后，可得以分离。结论-理论塔板数•从理论上可推导出理论塔板数n与保留时间、半峰宽与峰底宽的关系：•由上式可见，当tR一定时，理论塔板数越多，理论塔板高度越小