巢式PCR注意事项

巢式PCR注意事项巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应(PCR)，这两组(而非一对)PCR引物可用来扩增片段。第一对PCR引物扩增的片段与片段准相近。第二对引称为巢式引物(因为他们巢嵌在第一片段内部)。与第一段PCR产物结合，来指导第二段PCR产物的合成，这段产物比第一段产物要短。巢式PCR的好处是，如果错误的PCR产物被扩增，那么由第二段引物指导的第二次扩增的产物错误的可能性将是非常低的。巢式聚合酶链反应，巢式PCR需要两套引物用于放大特定的DNA片，应用两次单独的PCR来进行。第二对引功能扩增较小的特定DNA片段，该片段位于一次PCR产物内部。因此，巢式PCR扩增是非常特异的。第一步:目标DNA片段与第一段引物（兰色）结合。引物可能回选择性的结合于模板，相似的引物结合位点会产生多重的产物，然而，只有一段产物是我们预期的。第二步：应用一次PCR产物区段，通过二次新的引物结合位点进行二次PCR（红色）。这些引物嵌套在一次PCR产物的内部，因此，非特异性片段的产生是不太可能的，一次PCR产物包含着二次PCR引物的结合位点。这种巢式PCR产物保证了通过二次PCR得到的产物很少有或者没有污染（杂带，也就是产物是符合我们需要的）也就是没有非特异性的条带。注意事项：1。如果要提高扩增效果，具备回收的条件的话，回收后继续第二次PCR是没有问题的。如果不具备回收条件，不回收直接稀释后进行二次PCR也可，因为内引物同样具有相当的特异性，如果设计合理，第一次非特异性的扩增产物为模板，不能和第二对引物有效结合，这样的非特异产物的模板不能在第二次扩增中产生目的条带。这也正是NESTEDPCR的优点。2。主要是控制好引物的比例，也就是说，如果第一次PCR的引物如果过量的话，剩余引物二次PCR的时候同样能有一定的产量，这相对于第二次PCR而言就是非特异性的产物。解决的方法很简单，第一次PCR时，引物尽量摸索最低的加入量，增加循环次数，尽量消耗体系中残余的引物。二次PCR时，增加内引物的量，二者还是有一定竞争关系，道理不言而喻了。