产低温淀粉酶 脂肪酶 蛋白酶菌株筛选的设计方案

产淀粉酶脂肪酶蛋白酶菌株的筛选一实验目的：学会低温淀粉酶，脂肪酶，蛋白酶产生菌的筛选方法二实验原理：淀粉酶是能催化淀粉水解成糊精等小分子物质并进一步水解成葡萄糖、麦芽糖及其他低聚糖的一群酶的总称，淀粉水解后，碘不再变蓝色，因此可以在培养基上加适量的卢戈氏碘液，根据淀粉培养基上有无透明圈来判断是否该菌产生淀粉酶脂肪酶是一类在油－水界面上催化油脂降解为甘油和脂肪酸的酶类。吐温80为聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯，产脂肪酶的菌株能分解Tween80（吐温）在菌落周围形成白色沉淀圈。蛋白酶能将蛋白质分解成短肽甚至氨基酸，根据三氯乙酸能将酪蛋白变性产生沉淀，菌落周围不形成沉淀蛋白而出现透明圈，可在平板培养基上直接筛选蛋白酶产生菌株。三实验器材与试剂1菌株实验室提供的低温培养菌株2培养基(1)LB培养基：酵母提取物5g/L蛋白胨10g/LNaCL5g/L（琼脂20g/L）(2)低温淀粉酶产生菌筛选培养基：蛋白胨10g/L,酵母膏5g/L,NaCL5g/L，K2HPO43g/L,可溶性淀粉2g/L,琼脂20g/L,pH值为7.2-7.4(3)低温脂肪酶产生菌筛选培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl5g/L，CaCl0.1g/L吐温8010g/L琼脂粉20g/L，调pH至7.2(4)低温蛋白酶产生菌筛选培养基:酪蛋白10g/L葡萄糖0.5g/LNaCL5g/LK2HPO40.5g/LKH2PO40.5g/L琼脂20g/LPH7.53仪器及试剂高压蒸汽灭菌锅超净工作台恒温培养箱天平电炉PH计培养皿烧杯玻璃棒三氯乙酸卢哥碘液吐温-80NaOH1mol/LHCL1mol/L等四实验步骤1产淀粉酶菌株的筛选①将实验室已经分离保存好的菌种接种到LB斜面培养基使其活化，②将活化的菌株移接到液体培养基中，于最适温度、150r/min下振荡培养24～36h，制备成液体菌种。③用打孔法在固体的初筛培养基上均匀地打6个孔，用移液枪在每个孔中加0.2mL上述液体菌种，在最适温度下培养36h④加入卢戈氏碘液，观察菌落周围透明圈的有无及大小。2产脂肪酶菌株的筛选①将实验室已经分离保存好的菌种接种到LB斜面培养基使其活化，②将活化的菌株移接到液体培养基中，于最适温度、150r/min下振荡培养24～36h，制备成液体菌种。③用打孔法在脂肪酶的固体初筛培养基上均匀地打6个孔，用移液枪在每个孔中加0.2mL上述液体菌种，在最适温度下培养36h④观察菌落周围沉淀圈的有无及大小。3产蛋白酶菌株的筛选①将实验室已经分离保存好的菌种接种到LB斜面培养基使其活化，②将活化的菌株移接到液体培养基中，于最适温度、150r/min下振荡培养24～36h，制备成液体菌种。③用打孔法在脂肪酶固体初筛培养基上均匀地打6个孔，用移液枪在每个孔中加0.2mL上述液体菌种，在最适温度下培养2～3d④加入2.5%三氯乙酸溶液，观察菌落周围透明圈的有无及大小。五结果与分析记录每种菌与试剂作用后透明圈，沉淀圈的有无，及圈直径大小产生酶淀粉酶脂肪酶蛋白酶菌株本法系利用细菌不能通过致密具孔滤材的原理以除去气体或液体中微生物的方法。常用于气体、热不稳定的药品溶液或原料的除菌。除菌过滤器采用孔径分布均匀的微孔滤膜作为过滤材料，微孔滤膜分为亲水性和疏水性两种。滤膜材质依过滤物品的性质及过滤目的而定。药品生产中采用的除菌滤膜孔径一般不超过0.22μm.过滤器不得对被滤过成分有吸附作用，也不能释放物质，不得有纤维脱落，禁用含石棉的过滤器。滤器和滤膜在使用前应进行洁净处理，并用高压蒸汽进行灭菌或作在线灭菌。更换品种和批次应先清洗滤器，再更换滤膜。过滤过程中无菌保证与过滤液体的初始生物负荷及过滤器的对数下降值LRV（LogReductionValue）有关。LRV系指规定条件下，被过滤液体过滤前的微生物数量与过滤后的微生物数量比的常用对数值。即：LRV=lgN0-LgN式中N0为产品除菌前的微生物数量。N为产品除菌后的微生物数量。LRV用于表示过滤器的过滤除菌效率，对孔径为0.22μm的过滤器而言，要求每1cm2有效过滤面积的LRV应不小于7.因此过滤除菌时，被过滤产品总的污染量应控制在规定的限度内。为保证过滤除菌效果，可使用两个过滤器串连过滤，或在灌装前用过滤器进行再次过滤。在过滤除菌中，一般无法对全过程中过滤器的关键参数（滤膜孔径的大小及分布，滤膜的完整性及LRV）进行监控。因此，在每一次过滤除菌前后均应作滤器的完整性试验，即气泡点试验或压力维持试验或气体扩散流量试验。确认滤膜在除菌过滤过程中的有效性和完整性。除菌过滤器的使用时间不应超过一个工作日，否则应进行验证。过滤系统的验证包括过滤系统对过滤液体的适应性、过滤材料对溶液的污染程度、过滤器的规格、过滤器的灭菌方法、过滤系统的完整性试验、生物指示剂试验、过滤液体的微生物含量控制及过滤时间、过滤器的使用寿命等。上述试验大部分可由滤器的生产厂商来进行。微生物挑战性试验常用的生物指示剂为缺陷假单胞菌（Pseudomonasdiminuta）。通过过滤除菌法达到无菌的产品应严密监控其生产环境的洁净度，建议在无菌环境下进行过滤操作。相关的设备、包装容器、塞子及其它物品应采用适当的方法进行灭菌，并防止再污染。