4第四讲 细胞破碎 9.11 and 9.13解析

第四章细胞破碎CellDisruption细胞结构动物细胞：大多无细胞壁，其培养产物大多分泌在培养液中。植物细胞：多为胞内产物。微生物：大多数小分子代谢产物分泌在胞外；大多数大分子产物和基因重组产物为胞内产物，如胰岛素、干扰素、白细胞介素-2等均为胞内产物。对于胞内产物，首先必须将细胞破碎，使产物得以释放，才能进一步提取。有些目标产物不在发酵液中，而是存在于生物体中。基因工程菌产生的大多数蛋白质不会被分泌到发酵液中，而是在细胞内沉积。脂类物质和一些抗生素也是包含在生物体中。还有一些目标产物就是细胞本身，如面包酵母。使胞内产物释放出来一般需要破碎细胞壁，这也是这一章的主题。细胞破碎的方法在生物化学领域中得到了很广泛的运用，但多数在小规模生产中，在大规模生产尤其是基因工程中应用极少。概述化学破碎方法机械破碎方法TABLE4.0-1.ChemicalCellDisintegrationTechniquesMethodTechniquePrincipleStressCostExamplesChemicalOsmoticshockOsmoticruptureofmembraneGentleCheapRuptureofredbloodcellsEnzymedigestionCellwalldigested,providingdisruptionGentleExpensiveEgglysosymeSolubilizationDetergentssolubilizecellmembraneGentleModerate-expensiveBilesaltsactingonE.coliLipiddissolutionOrganicsolventdissolvesincellwallModerateCheapToluenedisruptionofyeastAlkalitreatmentSaponificationoflipidssolubilizesmembraneHarshCheap方法技术原理效果成本举例化学法渗透冲击渗透压破坏细胞温和便宜血红细胞的破坏酶消化法细胞壁被消化，使细胞破碎温和昂贵增溶法表面活性剂溶解细胞壁温和适中胆盐作用于大肠杆菌脂溶法有机溶剂溶解细胞壁并使之失稳适中便宜甲苯破碎酵母细胞碱处理法碱的皂化作用使细胞壁融解剧烈便宜MethodTechniquePrincipleProductCostExamplesMechanicalHomogenization(bladetype)CellschoppedinWaringblenderModerateModerateAnimaltissueandcellsGrindingCellsrupturedbygrindingwithabrasivesModerateCheapUltrasonicationCellsbrokenwithultrasoniccavitationHarshExpensiveCellsuspensionsatleastonasmallscaleHomogenization(orificetype)CellsforcedthroughsmallholearebrokenbyshearHarshModerateLargescaletreatmentofcellsuspensions,CrushinginballmillCellscrushedbetweenglassorsteelballsHarshCheapLargescaletreatmentofcellsuspensionsandplantcellsTABLE4.0-1.MechanicalCellDisintegrationTechniques方法技术原理效果成本举例机械法匀浆法（片型）细胞被搅拌器劈碎适中适中动物组织及动物细胞研磨法细胞被研磨物磨碎适中便宜超声波法用超声波的空穴作用使细胞破碎适中昂贵细胞悬浮液小规模处理匀浆法（孔型）须使细胞通过的小孔，使细胞受到剪切力而破碎剧烈适中细胞悬浮液大规模处理珠磨破碎法细胞被玻璃珠或铁珠捣碎剧烈便宜细胞悬浮液和植物细胞的大规模处理表4.0-1.细胞物理破碎法化学方法主要的几种化学方法，有渗透冲击法，表面活性剂增溶法、脂溶法。首先简单的介绍一下酶消化法和碱处理法。酶消化法和碱处理法都是细胞破碎的有效方法，但是也都有各自的缺点。原理：利用酶反应，分解破坏细胞壁上的特殊键，从而达到破壁的目的。自溶法——控制一定条件，诱发细胞自溶酶使细胞破碎。自溶法常采用加热法或干燥法。外加酶法——根据细胞壁膜的结构及组成选择合适的酶。细菌大多用溶菌酶(lysozyme)酵母菌常用溶酶有：β-1,3-葡聚糖酶(glucanase)、β-1,6-葡聚糖酶、蛋白酶(protease)、甘露糖酶(mannanase)、糖苷酶(glycosidase)、肽键内切酶(endopeptidase)、壳多糖酶等。酶溶法酶溶法需要特定的反应条件。酶具有高度专一性，必须根据细胞壁的结构和化学组成选择适当的酶或溶酶系统，并确定相应的次序。酶溶法的优点是：具有选择性释放产物条件温和，核酸泄出量少，细胞外形完整。酶溶法的不足：一是溶酶价格高；二是酶溶法通用性差，且不易确定最佳的溶解条件；三是存在产物抑制酶消化法的缺点在于酶的价格昂贵限制了在大规模生产中的使用，虽然条件温和、具有选择性。细胞悬浮液中加入酶能迅速和细胞壁反应并破坏它们。酶选择性的催化细胞壁反应，不破坏细胞内的其它物质。碱处理法和酶消化法相反，反应激烈，不具选择性，而且较便宜。碱加入细胞悬浮液中后和细胞壁进行了多种反应，包括使磷脂皂化。该操作是细胞增溶的很好的例子，因为它使细胞壁的成分溶于表面活性剂，也使蛋白质变性。该法不仅破坏了细胞壁也破坏了产物，因此即便很便宜，碱处理也是一种很不常用的方法。OsmoticShock(渗透冲击法)三种主要细胞破碎化学方法中最简单的是渗透冲击法。此法将一定体积的细胞液加到2倍体积的水中，细胞中溶质浓度高，水不断进入细胞，使细胞膨胀，最后导致破裂。细胞破裂后释放到周围环境中的胞内物可用后面章节介绍的方法分离。细胞破碎的难易决定于其类型，红血球细胞容易溶破。植物细胞很难溶破，因为植物细胞中含有大量的木质成分，通过渗透流很难渗透。机械破碎高压匀浆超声粉碎高压匀浆工作原理：利用高压使细胞悬浮液通过针形阀，由于突然减压和高速冲击撞击环使细胞破裂。在高压匀浆器中，高压室的压力高达几百个大气压，细胞悬浮液自高压室针形阀喷出时，速度可达每秒几百米。细胞的匀浆破碎过程可用下述一级反应方程式来描述：Ct/Cm＝1－e－t/ŧCt－破碎细胞经t时间后的产物浓度，mol/LCm－破碎细胞经可达的最高产物浓度，mol/Lŧ－细胞破碎的时间常数，随剪切强度和压力而改变，minJJ-2组织捣碎匀浆机2.Ultrasonication超声波超声波破碎仪破碎机理：可能与空化现象（Cavitationphenomena）引起的冲击波和剪切作用有关通常采用的超声破碎机在15～25KHz的频率下操作。超声破碎的效率与声频、声能、处理时间、细胞浓度及菌种类型等因素有关。细胞种类：杆菌比球菌较易破碎，革兰氏阴性细胞比革兰氏阳性细胞较易破碎，对酵母菌的效果较差。超声波振荡易引起温度的剧烈上升，操作时常在冷却条件下进行。小规模实验常采用间歇操作，大规模生产受限制。超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物质失活，因而有一定的局限性WSK卧式高效全能珠磨机3.Crushinginballmill珠磨法ZM系列卧式密闭珠(砂)磨机在珠磨法中，细胞的破碎率也能用一级速率方程式表示：ln[1/(1-R)]=KtK－破碎速率常数t－停留时间R－破碎率破碎速率常数K与许多操作参数有关，如搅拌转速、料液的循环流速、细胞悬浮液的浓度、玻璃小珠的装置和珠体的直径以及温度等。选择破碎方法的依据细胞处理量：大规模生产多采用机械法（通用性强，破碎效率高），实验室规模多选用非机械法（选择性好，固液易分离）。细胞壁的强度与结构目标产物对破碎条件的敏感性：对活性物质产品，要兼顾效率与稳定性。破碎程度：操作条件要兼顾产物释放率、能耗和便于后提取。破碎率的测定直接测定法——利用显微镜或电子微粒计数器直接计数破碎前后的细胞数（仅适合于机械法）目的产物测定法——通过测定破碎液中目的产物的释放量来估算破碎率。（多用于生产，必须有100%破碎率作标准数值比较）导电率测定法——细胞破碎后，大量带电荷的内含物被释放到水相，使导电率上升。（是一种快速测定法，应预先采用其他方法制定标准曲线）