实验九

•目的要求：•1、了解常用化学消毒剂对微生物的作用。•2、了解渗透压、pH对微生物生长的要求。•3、学习生长谱法测定微生物营养需要的基本原理和方法。•（一）基本原理•常用化学消毒剂主要有重金属类、有机溶剂、卤族元素及其化合物、染料和表面活性剂等。不同化学消毒剂对微生物的影响不同。有机溶剂可使蛋白质及核酸变性，也可破坏细胞膜透性使内含物外溢；碘可使蛋白质失活；染料可选择性抑制或杀死微生物。•本实验采用滤纸片法测定化学消毒剂的杀（抑）菌作用。•（1）将已灭菌并冷至50℃左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基倒入无菌平皿中，水平放置待凝固。•（2）用无菌吸管吸取0.1mL的菌悬液加入到上述平板中，用无菌三角涂棒涂布均匀。•（3）将已涂布好的平板底皿划分成5等份，每一等份内标明一种消毒剂的名称：75%酒精、0.1%升汞、3%碘酒、5%苯酚、0.2%结晶紫。•（4）用无菌镊子将小圆滤纸片（D5mm）分别浸入装有各种消毒剂溶液的试剂瓶中浸湿。•无菌操作将滤纸片贴在平板相应区域。•注意取出滤纸片时保证滤纸片所含消毒剂溶液量基本一致，并在试剂瓶内壁沥去多余药液。•（5）将上述贴好滤纸片的含菌平板倒置于37℃培养箱中，24h后取出观察抑（杀）菌圈的大小。•（一）基本原理•在等渗溶液中，微生物正常生长繁殖；在高渗溶液（例如高盐、高糖溶液）中，细胞失水收缩，而水分为微生物生理生化反应所必需，失水会抑制其生长繁殖；在低渗溶液中细胞吸水膨胀，细菌、放线菌、霉菌及酵母菌等大多数微生物具有较为坚韧的细胞壁，而且个体较小，受低渗透压的影响不大。•不同类型微生物对渗透压变化的适应能力不尽相同，大多数微生物在0.5%~3%的盐浓度范围内可正常生长，10%~15%的盐浓度能抑制大部分微生物的生长，但对嗜盐细菌而言，在低于15%的盐浓度环境中不能生长，而某些极端嗜盐菌可在盐浓度高达30%的条件下生长良好。•（1）将含不同浓度0、2.5、5.0、10%NaCl的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基熔化、倒平板。•（2）在已凝固的平板皿底用记号笔划成二部分，分别标记，两位同学各接一边。•（3）将上述平板置于37℃培养箱中，24h后观察并记录含不同浓度NaCl的平板上细菌的生长状况。•（一）基本原理•pH对微生物的生命活动的影响是通过以下几方面实现的：一是使蛋白质、核酸等生物大分子所带电荷发生变化，从而影响其生物活性；二是引起细胞膜电荷变化，导致微生物细胞吸收营养物质能力改变；三是改变环境中营养物质的可给性及有害物质的毒性。不同微生物对pH条件的要求各不相同，它们只能在一定的pH范围内生长，这个pH范围有宽、有窄，而其生长最适pH常限于一个较窄的pH范围，对pH条件的不同要求在一定程度上反映出微生物对环境的适应能力。•（1）无菌操作吸取5mL不同pH（3、5、7、9、11）的牛肉膏蛋白胨液体培养基于无菌试管中。•（2）接种：每支试管分别接入0.1mL待鉴定细菌的菌悬液。•（3）培养：5支试管置于37℃培养箱保温24h。•（4）观察记录：将上述试管取出，观察细菌生长状况（混浊程度）。•（一、基本原理•微生物的生长繁殖需要适宜的营养环境，碳源、氮源、无机盐、微量元素、生长因子等都是微生物生长所必需的，缺少其中一种，微生物便不能正常生长、繁殖。•在实验室条件下，人们常用人工配制的培养基来培养微生物，这些培养基中含有微生物生长所需的各种营养成分。如果人工配制一种缺乏某种营养成分（例如碳源）的琼脂培养基，涂布菌液于该培养基平板上，再将所缺乏的营养物质（各种碳源）点植于平板上，在适宜的条件下培养后，如果接种的这种微生物能够利用某种碳源，就会在点植的该种碳源物质周围生长繁殖，呈现出由许多小菌落组成圆形区域（菌落圈），而该微生物不能利用的碳源周围就不会有微生物的生长，最终在平板上呈现一定的生长图形。由于不同类型微生物利用不同营养物质的能力不同，它们在点植有不同营养物质的平板上生长图形就会有差别，具有不同的生长谱，故称此法为生长谱法。该法可以定性、定量地测定微生物对各种营养物质的需求，在微生物育种、营养缺陷型鉴定以及饮食制品质量检测等诸多方面具有重要用途。•（1）将基础培养基熔化并冷却至50℃左右，倒平板。•（2）接种：加入0.1mL菌悬液，涂布均匀。•（3）在皿底用记号笔划分成五个区域，并标明要点植的各种糖。•（4）用5张滤纸片分别浸取5种糖液对号点植。•注意点植时滤纸片不能含有过多糖液，糖过多时，糖溶液扩散区域过大会导致不同的糖相互混合。•（5）将平板倒置于37℃培养箱中培养24h，观察各种糖周围有无菌落圈。•注意:点植糖后不要匆忙将平板倒置。本次实验要求：1、结果记录：•（1）化学因素：记录抑菌圈大小，以此比较判断各试剂抑菌能力。•（2）渗透压：“-”表示不生长、“+”表示生长、“++”表示生长良好。•（3）pH：同渗透压。将培养液充分震荡后观察。•（4）营养要求：观察各滤纸片周围有无菌落圈及菌落圈大小，以此判断未知菌对五种碳源的利用情况。•2、思考题：要含有化学消毒剂的滤纸片周围形成的抑（杀）菌圈表明该区域培养基中的原有细菌被杀死或被抑制而不能生长，你如何用实验证明抑（杀）菌圈的形成是由于化学消毒剂的抑菌作用还是杀菌作用？•3、综合实验结果，对自己分离到的细菌进行初步鉴定。（实验报告单独写）