1000140药物分析_第十一章抗生素_1002

1第十一章抗生素类药物分析第一节概述特点：化学纯度较低,同系物多，异构体多，降解物多，稳定性差。鉴别方法：生物学法，理化方法特殊检查项目：异常毒性、热源或细菌内毒素、降压物质、无菌，组分分析，聚合物等。2含量测定或效价测定微生物学法——通过比较标准品与供试品产生抑菌圈的大小来测定供试品的效价。其原理恰好与临床应用要求一致，更能确定抗生素的医疗价值。对于分子结构复杂、多组分的抗生素，生物学法是首选的效价测定方法。3本法的优点：–灵敏、用量小，结果直观–适用范围广：纯度好的、差的制品，已知或新发现的抗生素均适用，同一类型的抗生素不需分离，可一次测定其总效价。缺点：–操作步骤多，测定时间长，误差大等。4理化方法——适用于提纯的产品以及化学结构已确定的抗生素优点：迅速、准确、有较高的专属性。缺点：对含有具同样官能团杂质的供试品不适用，或需采取适当方法加以校正。而且当该法是利用某一类型抗生素的共同结构部分的反应时，所测得的结果，往往只能代表药物的总的含量，并不一定能代表抗生素的生物效价。5第二节β-内酰胺类抗生素NSCH3CH3COOHRCOHNOAB1234567头孢菌素族青霉素族NSCOOHRCOHNOAB12345768CH2R1一、化学结构与性质*****6-氨基青霉烷酸7-氨基头孢菌烷酸6酸性：青霉素和头孢菌素分子中的游离羧基具有相当强的酸性，大多数青霉素的pKa在2.5～2.8之间，能与无机碱或某些有机碱形成盐。旋光性：青霉素族分子中含有三个手性碳原子，头孢菌素族含有两个手性碳原子，故都具有旋光性。7β-内酰胺环的不稳定性：β-内酰胺环是该类抗生素的结构活性中心，其性质活泼，是分子结构中最不稳定部分，其稳定性与含水量和纯度有很大关系。在酸、碱、青霉素酶、羟胺及某些金属离子（铜、铅、汞和银）或氧化剂等作用下，易发生水解和分子重排，导致β-内酰胺环的破坏而失去抗菌活性。8二、鉴别试验（一）呈色反应–羟肟酸铁反应青霉素及头孢菌素在碱性中与羟胺作用，β-内酰胺环破裂生成羟肟酸；在稀酸中与高铁离子呈色。–茚三酮反应（侧链含-氨基酸结构）–与重氮苯磺酸的偶合反应（侧链含酚羟基）–硫酸-甲醛试验9（二）各种盐的反应钾、钠离子的火焰反应有机胺盐的特殊反应（如普鲁卡因青霉素的重氮化-偶合反应）（三）色谱法高效液相色谱法（HPLC）薄层色谱法（TLC）中国药典收载的头孢菌素族药物和大多数青霉素族药物采用HPLC法进行鉴别。10（四）光谱法IR——各国药典对收载的β-内酰胺类抗生素几乎均采用了本法进行鉴别。该类抗生素共有的特征峰：–－内酰胺环羰基的伸缩振动（1750～1800）–仲酰胺的氨基、羰基的伸缩振动（3300cm-1±，1525cm-1±，1680cm-1±）–羧酸离子的伸缩振动（1600cm-1±、1410cm-1±）UV——利用最大吸收波长鉴定法或利用水解产物的最大吸收波长鉴定法。11三、特殊杂质的检查本类抗生素的特殊杂质主要有高分子聚合物，有关物质，异构体等，一般采用HPLC法控制其量，也有采用测定杂质的吸收度来控制杂质量的。12聚合物——HPLC法聚合物的检查采用分子排阻色谱法。分子排阻色谱法的分离原理为凝胶色谱柱的分子筛机制。色谱柱多以亲水硅胶、凝胶或经修饰凝胶如葡聚糖凝胶（sephadex）和聚丙烯酰胺凝胶（sepharose）等为填充剂。现以头孢他啶中头孢他啶聚合物的测定为例131.色谱条件与系统适用性试验用葡聚糖凝胶G-10（40～120m）为填充剂，玻璃柱内径1.3～1.5cm，床体积50～60mL；流动相A为含3.5%硫酸铵的0.01mol/L磷酸盐缓冲液（pH值7.0），流动相B为0.01%十二烷基硫酸钠溶液；流速为每分钟1mL；检测波长为254nm。以流动相A为流动相，用1mg/mL蓝色葡聚糖2000溶液进样200L进行测定，理论板数应不低于900，拖尾因子在0.75～1.5，对照品溶液以流动相B为流动相，重复进样200L，峰面积值的相对标准差应小于5.0%。排阻分子量在1000左右142.对照品溶液的制备：取头孢他啶对照品适量，精密称定，加水制成含头孢他啶100g/1mL的溶液，摇匀。3.测定法：取本品适量，精密称定，加水制成含头孢他啶20mg/1mL的溶液，立即进样200L，以流动相A为流动相进行测定，记录色谱图；另取对照品溶液200L注入液相色谱仪，以流动相B为流动相，记录色谱图，按外标法计算，本品含头孢他啶聚合物以头孢他啶计不得过0.3%。15自身对照外标法的原理：该法是利用特定条件下β-内酰胺类抗生素可以缔合成与高分子杂质有相似色谱行为的缔合物，即在Kav=0处表现为单一的色谱峰。以药物自身为对照品，测定其在特定条件下缔合时的峰响应指标；然后改变色谱条件，测定样品，记录样品色谱图中Kav=0处的高分子杂质峰的响应指标，按外标法计算，即得样品中高分子杂质相当于药品本身的相对含量。Kav=有效分配系数16自身对照液样品液流动相B——0.01%十二烷基硫酸钠溶液流动相A——含3.5%硫酸铵的0.01mol/L磷酸盐缓冲液缔合物高聚物A高聚物﹤A缔合物17有关物质和异构体例1头孢呋辛酯中有关物质和异构体的检查：–色谱条件与系统适用性试验：要求头孢呋辛酯A，B异构体之间、头孢呋辛酯A异构体与头孢呋辛酯△3-异构体之间的分离度R﹥1.5。–头孢呋辛酯A，B异构体、△3-异构体及E异构体峰的相对保留时间分别约为1.0、0.9、1.2及1.7和2.1。–异构体——供试品色谱图中A异构体峰的面积与A、B异构体峰的面积和之比应为0.48～0.55。–有关物质——按自身对照法测定，E异构体不得过1.0%；△3-异构体不得过1.5%；其他单个杂质不得过0.5%并规定了总杂质量不得过3.0%。181头孢呋辛；2异构体B；3异构体A；4△3-异构体；5,6E异构体△3-异构体是取头孢呋辛酯对照品经加热破坏处理而制得，E异构体经紫外光照射24h制得。头孢呋辛酯是由两个非对映异构体头孢呋辛酯A和B组成的混合物19吸光度如青霉素钠（钾）的吸光度检查：–取本品，加水制成每1mL中含1.80mg的溶液，照分光光度法，在280nm的波长处测定吸收度，不得大于0.10；在264nm的波长处有最大吸收，吸收度应为0.80～0.88。–此法中264nm处吸收值用来控制青霉素钠（钾）的含量，–280nm处吸收值用来控制杂质的量。20四、含量测定高效液相色谱法–这是β-内酰胺类抗生素含量测定的主要方法。中国药典收载的本类抗生素原料及制剂共约70种，应用HPLC法测定含量的有50多种，约占78%。–本类药物的HPLC法通常采用反相HPLC，以外标法计算含量。21第三节氨基糖苷类抗生素这类抗生素的化学结构都是以碱性环已多元醇为苷元，与氨基缩合而成的苷，故称为氨基糖苷类抗生素。主要有链霉素、庆大霉素、卡那霉素、新霉素及巴龙霉素、硫酸奈替米星、硫酸西索米星、硫酸依替米星等它们的抗菌谱和化学性质都有共同之处。22一、化学结构与性质链霉素OOHCHOOCH2OHOHOHNHCNH2NHHOOOHNHCH3ONHCH3OHNHCH2N123456链霉胍链霉糖N-甲基-L-葡萄糖胺streptidinestreptoseN-methyl-L-glucosamine链霉双糖胺stroptobiosamine1’2‘3’2“3”5”6“4’1”4”***链霉素23OOHNHCH3OHCH3OOCNH2R1HNHONH2NH2OR2R3****1234561’2‘3’4‘5’6‘1”2“3”4“5”*绛红糖胺2-脱氧链霉胺加洛糖胺purpurosaminedeoxystreptosaminegarosamine庆大霉素R1R2R3分子式C1CH3CH3HC21H43N5O7C2CH3HHC20H41N5O7C2aHHCH3C20H41N5O7C1aHHHC19H29N5O7庆大霉素24二、鉴别试验茚三酮反应——本类抗生素具羟基胺类和α-氨基酸的性质，可与茚三酮缩合成蓝紫色化合物。N-甲基葡萄糖胺反应——水解，产生葡萄糖胺衍生物，在碱性溶液中与乙酰丙酮缩合成吡咯衍生物，再与对二甲氨基苯甲醛的酸性醇溶液反应，生成樱桃红色缩合物。NCCH3CH3HHOCH2(CHOH)3O吡咯衍生物NCH3CH3CHNCOCH3CH3NCH3COCH3HH樱桃红色缩合物25麦芽酚（Maltol）反应在碱性溶液中，链霉糖经分子重排、扩环、消除反应，生成麦芽酚，与铁离子在微酸性溶液中形成紫红色配位化合物。OOHCHOOCH2OHOHOHNHCNH2NHHOOOHNHCH3ONHCH3OHNHCH2NH2ONaOHOCH3OOHH+Fe3+OCH3OOFe/3麦芽酚紫红色为链霉素的专属反应26坂口（Sakaguchi）反应——链霉素水溶液加氢氧化钠试液，水解生成链霉胍与8-羟基喹啉、次溴酸钠反应，生成橙红色化合物。RNCNH2NH2RNCNHBrNH2BrO-OH-RNCNBrNH2NNOHOOBrRNCNNH2BrO-NBrNNHCONHRO链霉胍8-羟基喹啉橙红色化合物-Br-RNCNNH2为链霉素的专属反应27三、特殊杂质检查及组分分析1、链霉素中链霉素B的检查链霉素B是指甘露糖链霉素，由发酵产生,其生物活性仅为链霉素的20%~25%，能被甘露糖链霉素B苷酶水解成甘露糖和链霉素。中国药典（2005）新规定了该项检查，采用薄层色谱法测定。28溶液配制供试品溶液：取本品0.25g，精密称定，置回流瓶中，加入5ml新鲜配制的硫酸-甲醇溶液（397׃）溶解，加热回流1h，冷却，用甲醇冲洗冷凝管，合并冲洗液，并用甲醇定量稀释成每1ml中含10mg的溶液，作为供试品溶液。对照溶液：精密称取甘露糖对照品约36mg，置回流瓶中，同法处理后定量制成每1ml中含72g的溶液，作为对照溶液。29TLC方法薄层板：硅胶G点样：各10μl，分别点于同一薄层板上展开剂：甲苯-醋酸-甲醇（5025׃25׃）显色剂：新鲜配制的1，3-萘二酚与硫酸混合溶液，在110C加热数分钟显色。限度：供试品溶液所显链霉素B斑点的颜色与对照溶液的主斑点比较，不得更深（3.0%）。L=×100%×100%=3.0%70×4.1310×1000C×4.13S×1000根据1mg甘露糖相当于4.13mg的链霉素B，则:限量？302、硫酸奈替米星中有关物质的TLC检查：供试品溶液：150mg/mL；标准品溶液（1）1.5mg/mL；标准品溶液（2）3mg/mL；标准品溶液（3）1.44mg西索米星/mL，点样：各2L，展开剂：二氯甲烷-甲醇-浓氨溶液（4：4：2）显色：0.2%茚三酮溶液，110℃加热20min。31结果：供试品溶液如显杂质斑点，其颜色–与标准品溶液（3）所显主斑点相比较，不得更深（1%），–其他杂质与标准品溶液（1）所显主斑点相比较，均不得更深（1%），–如有一点超过，应不深于标准品溶液（2）的主斑点（2%）。注：奈替米星是由西索米星经化学衍生而成的半合成抗生素，因此在奈替米星成品中有可能残留西索米星，需进行控制。样西对1对2供试品溶液：150mg/mL；标准液（1）1.5mg/mL；标准液（2）3mg/mL；标准液（3）1.44mg西索米星/mL323、庆大霉素C组分测定庆大霉素C1、C2、C1a对微生物的活性无明显差异，但其毒副作用和耐药性有差异，导致各组分的多少影响产品的效价和临床疗效。因此各国药典均规定控制各组分的相对百分含量。庆大霉素无紫外吸收，当采用HPLC-紫外检测器检测时，需进行衍生化处理。由于其具有强极性和水溶性，为获得理想的色谱结果，可采用离子对色谱法，以庚烷磺酸钠为反离子。33如USP（29）利用庆大霉素C组分结构中的氨基与邻苯二醛（OPA）、巯基醋酸在pH10.4的硼酸盐缓冲液中反应，生成1-烷基-2-烷基硫代异吲