第十九章药物研究的生物化学基础

第十九章药物研究的生物化学基础第一节生物药物制造的生物化学基础生物药物主要包括生化药物、微生物药物、生物技术药物和生物制品。制造技术的特点：1.目的物存在于组成非常复杂的生物材料中一种生物材料含有成千上万种成分，各种化合物的形状、大小、分子形式和理化性质各不相同，其中不少还是未知物，而且有效物质在制备过程尚处于代谢动态中，故常常无固定工艺可循。一、生物药物制备方法的特点2.有些目的物在生物材料中含量极微只达万分之一、十万分之一、甚至百万分之一，因此分离纯化步骤多，难于获得高收率。3.生物活性成分易变性、破坏4.生物药物制造受理化因素和生物学因素影响生物活性成分离开生物体后，易变性破坏，分离过程必须十分小心，以保护有效物质的生物活性。以致许多工艺设计理论性不强制造工艺几乎都在溶液中进行温度、pH、离子强度对溶液中各种组分的综合影响常常难于固定5.生物药物常采用“多阶式”法纯化一种有效物质常常要联用几个，甚至十几个步骤并变换不同类型的分离方法交互进行才能达到目的。为了保护目的物的活性及结构完整性即“逐级分离”法。6.生物药物的均一性检测与化学上的纯度概念不完全相同生物大分子类药物的分离纯化主要原理是：1）根据分子形状和分子大小不同的分离方法如，差速离心，超速离心，膜分离透析。电透析、超滤和凝胶过滤等。2）根据分子电离性质（带电性）不同的分离方法如，离子交换法、电泳法和电聚焦法等。3）根据分子极性大小与溶解度不同的分离方法如，溶剂提取法、逆流分配法、分配层析法、盐析法、等电点沉淀法和有机溶剂分级沉淀法。4）根据配基特异性不同的分离方法——亲和层析是指利用生物细胞的代谢反应（更多的是利用微生物转化反应）来合成化学方法难于合成的药物或药物中间体。生物合成：微生物转化反应：是指利用微生物的代谢作用来进行某些化学反应，确切地说就是利用微生物代谢过程中某种酶对底物进行催化反应，以生成所需要的活性物质。二、生物合成技术原理微生物转化产物特点：转化条件温和具有立体构型单一公害少后处理简便能进行某些化学反应难于进行或不能合成的反应为此，在制药工业中得到愈来愈广泛的应用，现已形成一个以遗传工程为指导，以发酵工程为基础，包括细胞工程和酶工程有机结合的生物合成技术体系，半合成技术：1）药物其部分结构由天然资源得到化学合成法制得最终产品＋2）化学合成的中间产物微生物转化法获得最终有效化合物＋生物技术（biotechnology）又称为生物工程（bioengineering），是利用生物有机体（动物、植物和微生物）或其组成部分（包括器官、组织、细胞或细胞器等）发展新产品或新工艺的一种技术体系。三、生物技术原理（前述）包括：发酵工程基因工程细胞工程酶工程基因工程技术的定义用人工方法，提取或制备某种细胞的某种基因，在体外把它和一种载体连接构造杂种DNA分子，然后导入受体细胞，让其复制与表达，以改变受体细胞的某些性状或产生人们所需的产物的工程技术。细胞工程的定义应用细胞生物学和分子生物学的方法,通过类似于工程学的步骤,在细胞整体水平或细胞器水平上按照人们的意愿来改变细胞内的遗传物质以获得新型生物或一定细胞产品的一门综合性科学技术。其技术涉及细胞融合技术、细胞拆和技术、染色体导入技术、基因转移技术、胚胎移植技术、细胞与组织培养技术等。酶工程的定义在酶反应器中,利用酶的生物催化作用,生产出人类所需要产品的一门科学技术。例如过去蔗糖几乎全部通过加工甘蔗或甜菜获得,但现在科学家利用α-淀粉酶等多种酶的催化作用,在酶反应器中将淀粉转化成和蔗糖具有同样甜度的高果糖浆。发酵工程发酵工程也称为微生物工程，是在最适合条件下，对单一菌种进行培养，是生物特定产品的一种生物工艺。单克隆抗体技术现代生物技术核心重组DNA技术生物工程药物是指运用重组DNA技术和单克隆抗体技术生产的多肽、蛋白质、激素和酶类药物以及疫苗、单抗和细胞生长因子类药物。工程菌（或细胞）的大量培养与目的蛋白的生产基因工程是生物技术中最重要的一种。目的基因制备载体的选择和制备DNA片段重组连接重组DNA导入受体细胞转化子的筛选DNA重组体的筛选DNA重组体的鉴定(一)基因载体（Vector）1、定义：携带目的基因片段进入受体细胞的DNA一个理想的载体应具备以下几个条件：（a）本身是一个复制子，能自我复制。载体在进入受体细胞后，可自身复制或插入到基因组中，随受体细胞的基因组一起复制。（b）分子量小，小分子的DNA制备时不易损伤，小分子DNA限制酶的切点少。（c）目的基因与载体连结后，可在受体细胞内转录，翻译成蛋白质产物（表达载体）。（d）能给寄主（受体）细胞提供可选择的标记：如抗药性，营养缺陷型或显色表型等，以利于筛选。（E）具有多克隆位点，便于目的基因片段与载体连接。(F)拷贝数多，便于分离提纯。2、载体的分类功能分类：克隆载体表达载体转移载体探针载体组成元件的来源分类:质粒（plasmid）载体噬菌体载体：如λ噬菌体载体、M13噬菌体载体杂合载体(如粘粒cosmid)病毒性载体：逆转录病毒载体、腺病毒载体等人工染色体载体3、克隆载体（cloningvector）（1）克隆载体的功能：用来克隆和扩增DNA片段（目的基因）的载体具备条件：（a）必须是一个复制子，能在受体细胞中复制。复制起点Ori复制区复制终点term（b）带有抗药性基因Tetr：编码膜蛋白，阻止Tet进入细胞Ampr：β-内酰胺环水解酶。Kanr：Kan～P,neo～pCamr：氯霉素乙酰基转移酶（C）具有多克隆位点（multiplecloningsits，MCS）载体上含有的一个人工合成的DNA片段，其上含有数个单一酶切位点，是外源DNA的插入部位具备条件：是载体中的一段碱基序列，由数个酶切位点组成。这些位点在载体上都是单一位点（d）可导入受体细胞pBR322质粒有两个抗药性基因，每个抗性基因中均含有单克隆位点，外源DNA插入后使相应的抗性基因失活，宿主细胞失去相应的抗药性，不能在含相应抗生素的培养基中生长，这一现象称为插入失活。质粒pBR322的抗性基因筛选示意图4、表达载体（expressingvector）（1）表达载体的功能：在受体细胞中表达外源基因的载体结构：克隆载体+表达构件—原核生物表达真核生物表达oriampr基础上加转录和翻译相关elementMCS（2）原核（大肠杆菌）表达载体表达载体=克隆载体+表达元件“启动子—核糖体结合位点—克隆位点—转录终止信号”“P—RBS—MCS—term”原核表达载体结构示意图用T7表达系统质粒的基本结构元件(3)哺乳动物表达载体（1）病毒载体整合性载体：外源基因通过这种载体与宿主细胞的染色体整合。如pSV系列载体游离型载体：外源基因与这种载体重组后，以病毒颗粒形式在宿主细胞内自行复制或在辅助病毒存在下进行复制。如痘苗病毒、腺病毒、杆状病毒和逆转录病毒等。（2）质粒载体常常是穿梭质粒载体。既含原核的复制位点和筛选标记，又含真核的复制位点筛选标记和表达构件。1.直接从染色体DNA分离如果物理图谱已确定，可用限制酶直接从原核生物，噬菌体及动物病毒基因组切取目的基因。（二）目的基因的来源（Isolation）2.化学合成要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列基因小3.从cDNA文库（cDNA文库）筛选目的基因将不同细胞类型或不同阶段细胞的mRNA逆转录成cDNA后,将所有cDNA混合体与载体进行连接后，将所有的重组体分子都引入宿主细胞并进行扩增，所得到的分子克隆的混合体称为cDNA文库。mRNAcDNA双链cDNA重组DNA分子cDNA文库反转录酶载体受体菌复制*从cDNA文库获取目的基因逆转录酶AAAATTTTAAAASI核酸酶DNA聚合酶Ⅰ碱水解TTTT4.从基因组文库（genomiclibrary）筛选目的基因采用限制酶将基因组DNA切成片段，每一个DNA片段都与一个载体分子拼接成重组DNA，然后将所有的重组体都引入宿主细胞并进行扩增，得到的分子克隆的混合体称为“基因组文库”。从基因组文库中通过杂交筛选得到目的基因片段。从细胞中分离基因组DNA、用Sau3A或MboI部分消化、回收大小在一定范围内的片段、构建重组体。组织或细胞染色体DNA基因片断克隆载体重组DNA分子含重组分子的转化菌限制性内切酶受体菌基因组DNA文库：存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合*从基因组DNA文库获取目的基因5.PCR或RT-PCR根据目的基因的核苷酸序列设计一对引物以基因组DNA为模板经PCR扩增目的基因。以mRNA或RNA为模板经RT-PCR扩增目的基因。（三）限制酶的应用限制酶(restrictionenzyme):一类专门切割DNA的酶。是一类能识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并与其特异结合，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类核酸内切酶。“Restrictionendonucleasesarebacteriaenzymewhichcut(hydrolyze)DNAintodefinedandreproduciblefragments.Inbacteriatheyformpartoftherestriction—modificationdefensemechanismagainstforeignDNA.Theyarebasicgenecloningtools.”1.定义：2.限制酶的识别和切割位点识别：4～6碱基对，多具有回文结构（palindrom），少数识别长序列为8个或8个以上碱基对，有的存在简并序列（有的核苷酸位点可以不同）。Sau3AIEcoRIPstⅠSmaⅠ5′GATCGAATTCCTGCAGCCCGGG3′3′CTAGCTTAAGGACGTCGGGCCC5′简并序列：GTYRAC——Y=C/TR=G/AYR=CG/CA/TG/TA∴HindⅡ可识别4个特定序列3.限制酶的切割方式(1)识别序列内两条链上交错切割，产生单链突出的粘性末端(2)对称处同时切断DNA的两条链，产生平端DNA片段4.限制酶的切割结果切割的结果：产生三种不同的末端平末端—bluntend5’突出—5’-protruding（cohesiveend）3’突出—3’-protruding（overhangtail）切割的化学本质：磷酸二酯键的断裂,形成含5’—P和3’—OH末端的两个DNA片段。对一特定的DNA而言，识别序列碱基对少的，则切点数多，产生的片段小。(四)重组体的构建1.粘性末端连接：用同一种酶裂解后，产生相同的粘性末端，很容易按照碱基配对的原则以氢键结合，在T4DNA连接酶的作用下，共价闭合。连接方式：定向取代双向插入（正向/反向）（双酶切）（单酶切）措施：载体酶切后，用AP（碱性磷酸酶）水解5’端的磷酸基团防止载体的自身环化。同一种限制酶切割DNA产生的粘性末端的连接GGATCCCCTAGGBamHⅠ的识别序列及切割部位GGATCCCCTAGGBamHⅠ含目的基因的DNA片段BamHⅠGCCTAG5'3'5'3'3'5'5'3'5'3'5'3'GGATCCCCTAGGGATCCG目的基因片段混合、退火GCCTAGGATCCG质粒载体含目的基因的重组质粒DNA连接酶双酶切DNA片段粘性末端的连接GGATCCCCTAGGBamHⅠBamHⅠBamHⅠGCCTAG5'3'5'3'5'5'5'3'5'3'3'GAATTCCTTAAGAATTCG目的基因片段混合、退火GCTTAAGATCCG重组质粒DNA连接酶EcoRIEcoRI5'GATCCGGCTTAAGATCCGGCTTAAEcoRI3'5'载体加入同聚体尾（homopolymerictail）连接TdT：末端转移酶，可将某种单一脱氧核苷酸逐一加到3’-OH上去。底物：3’粘性突出末端2.平端连接不同方式产生的平端DNA片段可以在T4DNA连接酶的作用下，与某些限制酶产生的平端载体相连接。在连接时，所用的ATP及T4DNA连接酶的浓度要比连接粘末端的高些。(五)重组体的转化受体细胞应具备下列