13-1氨基酸类药物

生化药物制造工艺第十三章生化药物的定义、分类、特点定义：具体运用生物化学研究方法，从生物体中经提取、分离、纯化等手段获得的天然存在的生化活性物质或将上述这些物质加以结构改造或人工合成创造出的自然界没有的新的活性物质，通称生化药物(Biochemicalmedicine)。酶类药物辅酶类药物核苷酸与核酸类药物多肽类药物氨基酸类药物蛋白质类药物多糖类药物脂类药物分类特点1．一般生物学特性：1天然生物药物是生物进化与自然选择的结果、组成、结构常较复杂，分子量一般较大，生物活性受到多种因素影响；来源于生物体或其基因表达产物及其修饰物，活性高，针对性强，具有补充调整、增强、抑制、替换或纠正代谢失调的功能。一般比化学药物更合理和更有效，毒性较低、安全性较高，副作用较小。2天然生物药物是新型生物药物的先导物，通过合理药物设计，可以创制疗效更高，作用更专一，更易为机体接受，副作用与不良反应更小的新药。3特点2．特殊生物学特性：1种属特异性免疫原性2非预期的多向性活性，一种细胞因子可有多种生物活性，多种细胞因子通过网络效应可产生同种生物活性。3特点3．化学特性：1含量低、杂质多、工艺复杂、收率低、技术要求高；结构复杂，生物活性受空间结构严格限制，稳定性差；2剂量小，活性高，对制品的均一性，有效性，安全性，稳定性，生物活性要求严格。故常有国际标准品的对照品作为测试对照。3有机溶剂分级分离、等电沉淀--------粗提物。离子交换层析、凝胶层析、超滤等技术--------提高了产品的纯度和收率多种层析技术、超速离心等--------高纯度的生化药物尿激酶从每1mg蛋白质活力不得少于35000单位提高到100000单位，高于英国药典及欧洲药典水平（70000单位），与日本药典相同。胰岛素，激肽释放酶都与国外先进水平相当。辅酶A标准从220U/mg提高到250u/mg。肝素钠出口产品也超过国外药典标准生物药物的资源植物动物动物脏器血液、分泌物及其它代谢物微生物海洋生物脑脑磷脂、卵磷脂、胆固醇、神经节苷酯等心细胞色素C、辅酶Q10、CoA、CoI、VD3等肺抑肽酶、纤溶酶原激活剂、肺表面活性剂肝RNA、iRNA、SOD、肝抑素、抑肽酶等脾DNA、RNA、脾转移因子、脾铁蛋白等胃肠及黏膜胃蛋白酶、胃膜素、内在因子、凝乳酶、肝素、硫酸糖糖苷肽（Sulglycotide）、舒血管肽等，另外还有一类胃肠肠道激素脑下垂体促皮质素（ACTH）、催乳素、促甲状腺素、生长激素、促性激素、中叶素、神经垂体素、缩宫素、加压素等胰“酶库”。Ins、胰高血糖素、胰酶、糜蛋白酶、胰蛋白酶、胰脱氧核糖核酶、胰脂酶、胶原酶、弹性蛋白酶、胆碱酯酶、血管舒缓素血液、胆汁、肾、胸腺、肾上腺、松果体、扁桃体、甲状腺、睾丸、羊精囊、骨、气管软骨、眼球、鸡冠等均为生化制药原料。此外小动物的分泌物（如蜂皇浆、蜂毒、蛇毒等）主要从以下脏器中制取生化药物毒蜥Exendin-4是自毒蜥唾液中提取的一种多肽，研究发现该多肽与人体内的GLP-1在序列上有53％的同源性，同GLP-1一样具有促进胰岛素分泌、抑制胰高血糖素分泌及保护胰岛β细胞等作用。2005年经FDA批准用于二型糖尿病的治疗。Exenatide是Exendin-4的人工合成品。Exenatide(艾塞那肽)麻省Transmolecular公司的科学家将放射性I－131附着于自蝎子毒液中提取的一种多肽制成药物，研究发现该药物具有靶向性，对晚期神经胶质瘤有较好疗效，患者只需要从外部注射这种化合物，而无需再进行化疗或放射治疗。该药物目前仍处于临床研究阶段。蝎毒肽微生物1利用微生物作为工具微生物的代谢物2微生物菌体3海洋生物1海藻类：已知的海藻有1万多种海洋动物类：腔肠动物类、节肢动物类、软体动物类、鱼类、爬行动物类、海洋哺乳动物类2海洋微生物：3僧袍芋螺齐考诺肽（ziconotide）最初由僧袍芋螺中提取，现已人工合成，是一种神经细胞钙通道阻断剂。作为一种非阿片类镇痛药物，用于治疗严重的慢性神经性疼痛，其鞘内注射剂经FDA批准于2005年上市。齐考诺肽（ziconotide）DidemninB是一种由7个氨基酸和2个羧酸组成的带有分枝的环缩肽,既能抑制蛋白质的合成,也能抑制DNA、RNA的合成,对黑色素瘤B16细胞周期作用的研究表明,它可杀伤各期细胞,尤以G1至S期细胞敏感，它可快速完全介导HL-60细胞凋亡。目前DideminB已能够人工全合成,该药完成了临床Ⅱ期实验,最有希望开发成治疗癌症的新药。此外第二代didemnins-脱氢didemninsB(aplidine)现也已进入临床实验。海鞘来源的抗癌肽DidemninB海兔体内存在着多种结构独特、生理功能各异的次生代谢产物,如萜类、毒素、甾体、大环内酯及肽类等,其中肽类化合物尤为引人注目。其中Dolastatin15和Dolastatin10已经完成全合成,并正在美国进行Ⅰ期和Ⅱ期临床试验,主要用于小细胞肺癌、卵巢癌、黑色素瘤和前列腺癌等实体瘤的治疗。海兔来源的抗癌作用肽第一节氨基酸类药物（一）氨基酸类的分类1蛋白质氨基酸：编码氨基酸非蛋白氨基酸：D型氨基酸、β-氨基酸、γ-氨基酸等2衍生氨基酸：谷氨酰胺、硫酸甘氨酸、磷葡精氨酸等34必需氨基酸：赖氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸等8种非必需氨基酸及半必需氨基酸5一、概述氨基酸的营养价值及其与疾病的关系治疗消化道疾病的氨基酸及其衍生物治疗肝病的氨基酸及其衍生物治疗脑及神经系统疾病的氨基酸及其衍生物用于肿瘤治疗的氨基酸及其衍生物其他氨基酸类药物的临床应用（二）氨基酸及其衍生物在医药中的应用二、氨基酸的生产方法蛋白水解法：胱氨酸、半胱氨酸化学合成法：甘氨酸、蛋氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸等发酵法：苏氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、精氨酸、组氨酸、脯氨酸、鸟氨酸、瓜氨酸、赖氨酸、亮氨酸等酶法：丙氨酸、天冬氨酸、色氨酸等微生物生物合成法：L-丝氨酸等（一）水解法1、基本原理及其过程：水解→分离→精制结晶（1）蛋白质水解酸水解法：水解迅速，产物为L型氨基酸（有活性）（6～10mol/LHCl或8mol/LH2SO4)注意：①酸水解中色氨酸全部被破坏②含羟基的丝氨酸、酪氨酸部分被破坏③水解产物可与醛基化合物生成一类黑色物质，而使水解液呈黑色，需脱色处理碱水解法：产物为D型氨基酸（消旋体，无活性）（6mol/LNaOH或4mol/LBa(OH)2）酶水解法：生产水解蛋白和蛋白胨，最温和(蛋白水解酶)（2）氨基酸的分离方法溶解度法、特殊试剂法、吸附法、离子交换法溶解度法：溶解度的差异特殊试剂法：游离的精氨酸苯亚甲基精氨酸精氨酸苯甲醛游离的组氨酸汞盐组氨酸游离的亮氨酸盐亮氨酸磺酸邻二甲苯处理氨水HClgCl2H4（3）氨基酸的精制方法结晶、重结晶、溶解度与重结晶结合吸附法：吸附剂对氨基酸的吸附能力不同离子交换法：离子交换剂对氨基酸的吸附力不同2、水解法生产L-胱氨酸特点pI5.05，不溶于乙醇、乙醚和丙酮，可溶于无机酸或无机碱工艺：胱氨酸滤液粗品Ⅱ滤液粗品Ⅰ水解液毛或发）～氨水中和（、活性炭粗制：）中和（、活性炭粗制：）中和（酸水解LpHClpHNaOHlpHaOH0.45.3H8.4HC8.4N问题：1、分离L-胱氨酸的原理？2、为什么要加活性炭？3、粗品Ⅰ中除了具有L-胱氨酸外，还可能含有什么氨基酸？（上网查查）（二）发酵法1、基本原理及过程基本原理：利用微生物酶的作用，将培养基中有机物转化为细胞或其他有机物的过程。过程：培养基的配置与灭菌处理、菌种诱变与选育、菌种的培养、灭菌与接种发酵、产品提取与分离纯化2、L-赖氨酸的制备（发酵法）赖氨酸的性质及作用：发酵法的工艺：①原料：黄色短杆菌、谷氨酸棒杆菌、乳糖发酵短杆菌、诺卡杆菌②碳源：葡萄糖、醋酸、乙醇、石蜡③工艺流程④工艺控制要点工艺控制要点A、菌种培养：斜面培养基B、灭菌发酵：发酵温度（前期32℃、中后期30℃）、发酵pH值（6.5～7.0）C、发酵液的处理：先除去菌体和杂质离子，再对发酵液进行提取除去菌体和杂质离子的方法：离心分离、加絮凝剂法发酵液的提取方法：离子交换树脂法、沉淀法、有机溶剂抽提法问题：为什么可以用阳离子交换树脂法莱提取？D、浓缩结晶E、精制（重结晶）F、检验（三）酶法特定酶作用下转化为相应的氨基酸。1、原理微生物、植物细胞、动物细胞或酶进行固定化前体制备（化学合成，生物合成，天然存在）生物反应器含氨基酸的反应液氨基酸2、酶转化法生产氨基酸的过程底物﹢合成结构分子量等电点性质溶解性L-AspL-AlaHOOCCHNH2COOHCH2CHNH2COOHH3C133.1089.092.776.0酸性氨基酸中性氨基酸溶于水和盐酸，不溶于乙醇和乙醚在水中有一定溶解性，不溶于丙酮及乙醚3、L-天冬氨酸和L-丙氨酸的生产（1）L-天冬氨酸和L-丙氨酸的性质HOOCCHCOOHCHHOOCCHNH2COOHCH2CHNH2COOHH3C+CO2天冬氨酸酶L-Asp脱羧酶（2）酶转化反应（丁烯二酸）（L-丙氨酸）（L-天冬氨酸）（3）工艺路线固定化L-Asp脱羧酶转化液B延胡索酸+NH3固定化天冬氨酸酶转化液AL-Asp粗品L-Asp精品L-Ala粗品L-Ala精品泵储罐反应产物离心机母液回收固定化酶柱子晶体L-AspL-Asp延胡索酸氨盐工艺路线示意图（4）工艺控制要点①菌种的培养：大肠杆菌（E.coil）AS1.881的培养——含天冬氨酸酶德阿昆哈假单胞（Pseudomonasdacunhae)68变异株的培养——含L-天冬氨酸-β-脱羧酶②细胞固定：大肠杆菌（E.coil）的细胞固定方法是凝胶包埋，加戊二醛交联思考题：1.为什么用细胞固化，而不同酶固定化，有何优势？2.为什么要加戊二醛交联？假单胞菌体固定思考题：为什么要加乙二胺？③生物反应堆的制备（分Ⅰ和Ⅱ）④转化反应（温度、pH值、催化剂）两个反应堆的温度：37℃两个反应堆的pH值：反应堆Ⅰ：8.5；反应堆Ⅱ：6.0思考题：1、制备中为什么要调pH值？2、在反应过程中为什么要加磷酸吡哆醛？3、同时要加入Mn2+、Mg2+、Ca2+，其作用是什么？⑤产品纯化与精制（5）检验（6）作用本节重点氨基酸类药物的制造方法L-胱氨酸、L-赖氨酸、L-天冬氨酸和L-丙氨酸的制备原理和工艺控制要点课后作业1、生化药物的特点？2、简述酶法制备L-天冬氨酸和L-丙氨酸的原理及过程。3、在水解法制备L-胱氨酸的工艺路线中，分离L-胱氨酸的原理是什么？为什么要加活性炭？