第二章-基因工程基础(1)

生物技术制药第二章基因工程基础（1）基因工程基础DNA的体外重组外源基因表达系统生物技术制药一些基因工程相关问题2.1DNA的体外重组DNA体外重组的主要步骤目的基因的分离基因工程载体含目的基因的DNA片段与载体的连接重组体转入宿主(受体)细胞重组体克隆的筛选和鉴定外源基因表达产物的活性测定外源基因表达产物的分离纯化生物技术制药2.1.1基因工程操作中常用的工具酶限制性内切酶（限制-修饰系统）连接酶聚合酶基因工程修饰酶生物技术制药2.1.1.1限制性内切酶通过切割相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸二酯键，导致核酸分子多核苷酸链水解断裂的蛋白酶叫做核酸酶。从核酸分子的末端开始，逐个降解核苷酸，这种酶叫做核酸外切酶。从核酸分子的内部水解磷酸二酯键使之断裂成小片段，称为核酸内切酶。限制性内切酶是一类能识别双链DNA分子中特定核苷酸序列，并在识别序列内或附近特异切割双链DNA的核酸内切酶。生物技术制药限制-修饰系统在菌体细胞中有一对酶：限制性核酸内切酶和DNA甲基化酶，它们对DNA底物有相同的识别序列，但有相反的生物功能。甲基化酶具有种属专一性，只修饰宿主本身的DNA，避免了限制酶对宿主DNA的破坏，对于外源DNA，甲基化酶不能识别，而由限制酶将其水解。有时，甲基化酶发生差错，误将外源DNA分子修饰，限制酶就不能将其水解，这些外源DNA复制后的产物再次感染同一品系的菌体时就将被认为是自身DNA被加以修饰，从而大量繁殖。限制-修饰系统的存在保证了物种的遗传稳定，同时也有利于进化的进行。生物技术制药甲基化酶大肠杆菌中多含有两种DNA甲基化酶即dam和dcm甲基化酶。dam可在5-GATC-3序列中的腺嘌呤N6位置上引入甲基，而dcm则在5-CCAGG-3或5-CCTGG-3中的胞嘧啶C5位置上引入甲基。很多较高等的真核生物含有在特定位点CpG和CpNpG的DNA甲基化酶，可使上述序列的胞嘧啶C5位置上甲基化。在哺乳动物基因组中,甲基化主要发生在CG序列，在植物基因组中甲基化可发生在CG和CNG序列。生物技术制药甲基化与限制酶选择在选择限制酶时要注意所选限制酶对甲基化的敏感性，并应根据DNA的不同来源选择不同的限制酶。对某些位点特异性甲基化作用不敏感的限制酶，适用于对修饰的DNA进行完全消化。生物技术制药限制性内切酶分类Ⅰ型限制性内切酶属复合功能酶，兼具限制、修饰两种功能。需要Mg2＋、ATP和S-腺苷蛋氨酸作为辅助因子。具有特定的识别位点，但没有特定的切割位点，一般切割位点距识别位点400bp以上，并对识别位点进行随机切割，很难形成稳定的特异的切割末端，在基因工程中没有应用价值。Ⅲ型限制性内切酶也属复合功能酶，有特异的识别位点和切割位点，切割位点距识别位点3端24～26bp，需要Mg2＋、ATP和S-腺苷蛋氨酸激活，因为已发现的Ⅲ型限制性内切酶种类太少，基因工程中不常用。生物技术制药Ⅱ型限制酶的特点有特定的识别序列，长度一般为4～6nt，且呈二重对称；有特定的酶切位点，能在其识别序列的特定位点处对双链DNA进行切割，产生特定的酶切末端，有三种形式；其限制-修饰系统由两种酶组成：一是限制酶；二是独立的甲基化酶，它能修饰与限制酶识别位点相重叠的序列。生物技术制药Ⅱ型限制酶的酶切末端形式5突出黏端：如EcoRI：5-GAATTC-35-GAATTC-3-CTTAAG--CTTAA-G-3突出黏端：如PstI：5-CTGCAG-35-CTGCAG-3GACGTC-GACGTC-平端：如SmaI：5-CCCGGG-35-CCCGGG-3GGGCCC-GGGCCC-生物技术制药限制酶切反应的关键因素底物DNA的纯度和物理特性反应系统反应体积孵育(保温)时间和温度生物技术制药底物DNA(1):纯度酶切反应要求最严的成分是底物DNA，酶切产物直接受DNA底物纯度的影响。制备不当的DNA样品不能或只能部分切割。污染核酸虽不会显著影响酶切反应的效率，但会使反应产物的检测变得困难。例如，应用快速裂解法筛选阳性克隆，跑电泳时，切下的DNA可能会与tRNA处于相同位置。(此时，可用无DNase的RNase处理，或别的方法纯化样品，如用RPC-5类似物的小柱。)生物技术制药底物DNA(2):残留试剂酶切前，通常要经酚抽提除去DNA样品中的污染蛋白质。其中所用的试剂如高浓度的Hg、酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS及NaCl均会干扰酶切反应，有的甚至会改变酶的识别序列的特异性，故应在酶切前经透析等方法将这些干扰物质去除，DNA研究中常用的药物如放线菌素(actinomycin)和偏端霉素(distamycin)亦应除去。生物技术制药底物DNA(3):识别序列限制酶对DNA序列呈高度特异性，识别序列内核苷酸的甲基化或糖苷化会影响酶切反应。识别位点接近末端的程度也会影响酶的切割，如HpaⅡ和MboⅠ要求识别序列前至少有一个碱基对存在才能切割。双链六核苷酸识别序列GAATTC(EcoRⅠ)、GGATCC(BamHⅠ)和AAGCTT(HindⅢ)对酶切有抗性，但EcoRⅠ的识别序列延长一个碱基，变成GAATTCA，则可被EcoRⅠ切割。生物技术制药底物DNA(4):高级结构识别序列/切割位点的二、三级结构也会影响酶切效率。一般说来，完全切割超旋质粒或病毒DNA，要比切割线状DNA需要更多的酶。超旋DNA可先用酶将它线性化，或用拓扑异构酶(topoisomerase)使其松解，这样只许较少的酶便能完全切割。生物技术制药反应系统(1):缓冲液各种成分均应无酶(特别是核酸酶)活性，无重金属污染。所有母液均应过滤或高压除菌，然后冰冻保存并定期更换。几种试剂可混合配成10母液，使用时用灭菌水适当稀释即可。Tris最常用，它的毒性最小，适于pH7~8的实验，但温度系数很大，配制时应注意调整。甘氨酸对pH9的酶反应很有用。BRL公司的10核心缓冲液适用于18种限制酶。生物技术制药反应系统(2):金属离子Ⅱ型限制酶以Mg2为唯一的辅因子，用EDTA完全螯合Mg2可有效终止反应。某些酶以Mn2为辅因子，这种更换会使有些酶如EcoRⅠ、HindⅢ的识别特异性发生改变。离子强度合适，会激发酶切反应，不合适则会抑制反应，甚至导致识别活性丧失，因此对离子强度应仔细选择并认真计算。生物技术制药反应系统(3):保护剂为保护限制酶在长期孵育或储存过程中的酶活性不受蛋白酶、非特异性吸附以及热、表面张力和化学品等可导致变性的有害因素的影响，通常在其制剂中会加入牛血清白蛋白(BSA)或明胶等作为保护剂。只有无核酸酶污染的BSA溶液或无重金属污染的的明胶才能用于酶切反应。过量BSA结合的DNA在跑电泳时，有时会引起拖尾现象，上样前加入SDS、65℃加热可消除。生物技术制药反应系统:(4)甘油加在限制酶制剂母液中的甘油对酶活有稳定作用，并能防止长期低温(20℃)保存时发生冻结。但甘油也会使酶的识别特异性下降。一般说来，甘油含量应低于5%(终浓度)。此外，水质的重要性亦不应忽视，所有缓冲液及反应成分均应用无离子、无有机物的重蒸水或去离子水。生物技术制药限制酶的第二活性:星活性星活性(staractivity)是指严格典型的识别序列特异性被放宽而导致在DNA内产生附加的切割，在该酶名称的右上角加星号表示之。如EcoRⅠ的识别序列为GAATTC，EcoRⅠ*的识别序列放宽为AATT。造成星活性的因素有：甘油浓度、离子强度、pH值、有机溶剂、二价阳离子、酶与DNA之比。生物技术制药可产生星活性的一些条件酶:DNA比为50U/g，甘油浓度为7.5%(V/V)酶:DNA比低于10U/g，甘油浓度高于20%降低有机溶剂二甲亚砜(DMSO)、乙醇、乙二醇和二氧六环等水平时，如DMSO终浓度为1~2%(V/V)需高盐浓度(100mM)的酶降低盐浓度时，如BamHⅠ在酶:DNA比为100U/g，NaCl为100mM时，在一个位点切割pBR322；NaCl为50mM时，可在两个位点切割；无NaCl时则在八个位点切割。Ⅰ生物技术制药某些限制酶诱导星活性的反应条件酶诱导星活性的条件酶诱导星活性条件AvaⅠA,B,DHpaⅠA,B,DBamHⅠABCDEHPstⅠA,B,D,GBstⅠB,DPvuⅡB,DBsuⅠB,D,FSalⅠA,B,D,GEcoRⅠA,B,D,E,FSstⅠB,D,GHacⅢB,DSstⅡB,DHhaⅠB,D,GXbaⅠB,D,GHindⅢEA,乙二醇(45%);B,甘油(12~20%);C,乙醇(12%);D,高酶:DNA比(25U/g)E,Mn2替代Mg2;F,pH8.5;G,DMSO(8%);H,无NaCl.生物技术制药使用限制酶时应注意的问题(1)仔细查阅酶的识别序列和切割位点。有时，两种酶的识别序列不同，但切割后所产生的黏端却相同，这类酶称为同裂酶(isoschizomer)，如BamHI、MboI、BclI、Sau3A、XhoⅡ和BglⅡ就属于这类酶，它们的识别序列不同，但都产生5-黏端5-GATC-3。同裂酶为具不同酶切位点的DNA片段的重组提供了方便，但要注意，相容的黏端在用DNA连接酶连接后，往往都不能被该酶切割。生物技术制药使用限制酶时应注意的问题(2)注意说明书中所列的“comments”的内容,这里常会提供有关限制酶识别序列中位点特异性甲基化的信息及引起酶产生星活性的原因。注意酶的浓度，酶切时不是酶加得越多越好。根据DNA的量选择适当的酶量，既可避免不必要的浪费，又能保证酶切的质量。一般以在20L反应体积中，37℃，每小时水解1微克的酶量定为一个酶单位。生物技术制药使用限制酶时应注意的问题(3)注意酶在孵育过程中的活性变化。相同反应条件的酶可以同时酶解DNA样品，特别是在需要快速知道酶切结果时，显得更为有用。要注意酶的保存及保存时间。生物技术制药连接酶(1)T4DNA连接酶：它催化DNA的5磷酸基与3羟基之间形成磷酸二酯键。它的用途，一是连接带匹配黏端的DNA分子，二是使平端的双链DNA分子互相连接或与合成的寡核苷酸接头连接。后一类反应要比黏端之间的连接慢得多，但单价阳离子(150~200mMNaCl)或低浓度聚乙二醇(PEG)可提高平端之间的连接效率。连接酶(2)大肠杆菌DNA连接酶：它所行使的催化反应与T4DNA连接酶基本相同，只是它的催化反应需要NAD参与。T4RNA连接酶：它催化单链DNA或RNA的5-磷酸与另一单链DNA或RNA的3-羟基之间形成共价连接。用于基因工程的修饰酶DNA聚合酶依赖于DNA的RNA聚合酶T4噬菌体多核苷酸激酶碱性磷酸酶目前常用的DNA聚合酶大肠杆菌DNA聚合酶ⅠKlenow片段，即大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的大片段T4(噬菌体)DNA聚合酶T7(噬菌体)DNA聚合酶耐高温DNA聚合酶，如Taq(DNA)聚合酶不同来源的DNA聚合酶具有各自的酶学特性大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ具有5→3DNA聚合酶活性、及5→3和3→5外切核酸酶活性。Klenow片段是经枯草杆菌蛋白酶裂解完整的DNA聚合酶Ⅰ或用基因工程手段去除全酶中的5→3外切酶活性片段得到的、具有5→3DNA聚合酶活性和3→5外切酶活性的大片段。T4和T7DNA聚合酶T4DNA聚合酶的酶活性与Klenow片段相似，不过它的3→5外切酶活力比Klenow片段强近200倍。与Klenow片段相比，T4DNA聚合酶的最大特点是不从单链DNA模板上置换寡核苷酸引物，因此在体外突变反应具有更高的效率。T7DNA聚合酶所催化合成的DNA的平均长度要比其它DNA聚合的大得多。反(逆)转录酶反转录酶是一种依赖于RNA的DNA聚合酶。反转录酶具有5→3DNA聚合酶活性和RNaseH活性(5→3及3→5