酪蛋白的制备

实验五从牛奶中分离奶油、酪蛋白和乳糖牛奶的化学成分很复杂，至少有100多种，主要成分由水、脂肪、磷脂、蛋白质、乳糖、无机盐等组成。一般牛奶的主要化学成分含量为：水分：87.5%脂肪：3.5%蛋白质：3.4%乳糖：4.6%无机盐：0.7%组成人体蛋白质的氨基酸有20种，其中有8种是人体本身不能合成的，这些氨基酸称为必需氨基酸。我们进食的蛋白质中如果包含了所有的必需氨基酸，这种蛋白质便叫作全蛋白。牛奶中的蛋白质便是全蛋白。牛奶中的无机盐也称矿物质。牛奶中含有Ca2+、Mg2+、K+、Fe3+等阳离子和PO43-、SO42-、Cl-等阴离子；此外还有微量元素I、Cu、Zn、Mn等。这些元素绝大部分都对人体发育生长和代谢调节起着重要作用。钙是人体中含量最高的无机盐，是构成骨骼和牙齿的主要成分。人体中90%的钙集中在牙齿和骨骼上。儿童、青少年生长发育需要充足的钙，同样孕妇及成人、中老年人，也需要补充钙质，缺乏钙会影响牙齿和骨骼的正常发育，导致佝偻病。大自然中的钙是以化合态存在的，只有被动、植物吸收后形成具有生物活性的钙，才能更好地被人体所吸收利用。牛奶中含有丰富的活性钙，是人类最好的钙源之一，1升新鲜牛奶所含活性钙约1250毫克，居众多食物之首，约是大米的101倍、瘦牛肉的75倍、瘦猪肉的110倍，它不但含量高，而且牛奶中的乳糖能促进人体肠壁对钙的吸收，吸收率高达98%，从而调节体内钙的代谢，维持血清钙浓度，增进骨骼的钙化。吸收好对于补钙是尤其关键的。故牛奶能补钙这一说法是有其科学道理的。一、实验目的1．从牛乳中提取奶油、酪蛋白及乳糖。2．对酪蛋白进行纯化。3．掌握考马斯亮蓝法测定含量4．掌握SDS-PAGE法测定酪蛋白分子量。二、实验原理牛奶含有半乳糖、蛋白质、脂肪成份。蛋白质主要是酪蛋白，含量约为35g/l。酪蛋白在乳中是以酪蛋白酸钙-磷酸钙复合体胶粒存在，胶粒直径约为20～800纳米，平均为100纳米。在酸或凝乳酶的作用下酪蛋白会沉淀，加工后可制得干酪或干酪素。本实验利用加酸，当达到酪蛋白等电点PH=4.7时，酪蛋白沉淀。再通过离心而获得的沉淀即为酪蛋白，沉淀物中所含的脂肪通过有机溶剂抽提而去除，最终得到纯白色、晶状酪蛋白。剩下的液体为乳清，在乳清中含有乳白蛋白和乳球蛋白，还有溶解状态的乳糖，乳清中糖类的99.8%以上是乳糖，可通过浓缩、结晶制取乳糖。考马斯亮蓝G-250（CoomassiebrilliantblueG-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。该法是1976年Bradford建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1000μg／mL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。三、实验材料、主要仪器和试剂1．实验材料牛奶、200目的尼龙布2．主要仪器：离心机、、离心管、水浴锅、pH计、具塞试管、试管架、烧杯、量筒、微量取样器、分光光度计3．试剂：0.2mol/LHAc-Nabuffer、95%乙醇、乙醚、（1）牛血清白蛋白标准溶液的配制：准确称取100mg牛血清白蛋白，溶于100mL蒸馏水中，即为1000μg／mL的原液。（2）蛋白试剂考马斯亮蓝G-250的配制：称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50mL90％乙醇中，加入85％（W／V）的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1000mL。此溶液在常温下可放置一个月。（3）乙醇（4）磷酸（85％）四、操作步骤1．奶油的制备：牛奶中的脂肪含量在3．4％～3．8％之间，以极微小微明的小球悬浮于乳的液体内，由于比重小，一般都聚集在奶的表层。（1）从牛奶中分离生奶油：取80ml鲜奶，离心后取出上层奶油。奶油放入冰箱。（2）24小时后从冰箱中取出奶油，搅打观察其变化并记录。2．酪蛋白的制备：（1）取10mL脱脂牛奶加热到40℃，倒人50ml离心管中，在搅拌下慢慢加入预热到40℃、PH4．6的o．2mo1／L乙酸—乙酸钠缓冲液10mL、用pH试纸或酸度计检验，混合物的最后PH应是4．7。（2）将上述悬浮液冷却至室温，离心5min(5000r／min)。弃去上清液，得酯蛋白粗制品(沉淀物)。（3）纯化：用水洗沉淀2次；向沉淀中加入20ml左右的水(用玻棒将沉淀充分打碎)，离心5min(5000r／min)，弃去上清液。用乙醇、无水乙醚洗涤沉淀：在沉淀中加入20mL95％乙醇，搅拌片刻(尽可能充分地把沉淀块状打碎)，将全部悬蚀浓转移至布氏漏斗中抽滤。用无水乙醇—无水乙醚混合液（等体积）洗沉淀2次，抽干。最后用无水乙醚洗沉淀2次，抽干。(4)将沉淀摊开在表面皿上，风干，得酪蛋白纯品。3.从牛奶中分离乳糖牛奶中的乳糖含量为4．5％，是乳中的特有产物。（1）在除去酪蛋白的乳清中，加入1.5gCaCO3粉末，搅拌均匀后加热至沸。加CaCO3的目的一方面是中和溶液的酸性，防止加热时乳糖水解，另方面又能使乳白蛋白沉淀。（2）过滤除去沉淀，在滤液中加入1～2粒沸石，加热浓缩至3～5ml，加入10ml95%乙醇（注意离开火焰）和少量活性炭，搅拌均匀后在水浴上加热至沸腾，趁热过滤，滤液必须澄清。（3）加塞放置过夜，乳糖结晶析出，抽滤，用95%乙醇洗涤产品。（4）乳糖成脎试验取自制乳糖溶于少量水中，浓度约为5%，在试管中加入1ml乳糖溶液，1ml苯肼试剂，摇匀，试管口用棉花塞住，在沸水浴中加热，并不时振摇，加热10～15分钟后，取出放置冷却，乳糖脎成结晶析出。取少量乳糖脎在显微镜下观察其结晶形态，可证实为乳糖。①苯阱试剂有毒，小心使用，勿触及皮肤，如触及皮肤先用稀醋酸洗，再用水洗。（选做）（5）旋光法测定含量（选做）见资料中nunai4．计算酪蛋白的质量浓度和得率准确称量从牛奶中分离出的酷蛋白纯品。(1)计算酪蛋白实际的质量浓度实际质量浓度以1L，牛奶中酪蛋白的质量(g)表示。(2)计算得率酪蛋白得率／％＝酪蛋白实际的质量浓度/酪蛋白的理论质量浓度×100式中：牛奶中酪蛋白的理论质量浓度为35g/L5．酪蛋白纯度测定－考马斯亮蓝法1．标准曲线制作（1）0~100μg／mL标准曲线的制作：取6支10mL干净的具塞试管，按表1取样。盖塞后，将各试管中溶液纵向倒转混合，放置2min后用1cm光经的比色杯在595nm波长下比色，记录各管测定的光密度OD595nm，并做标准曲线。表1低浓度标准曲线制作管号1234561000μg／mL标准蛋白液（mL）00.020.040.060.080.10蒸馏水（mL）1.000.980.960.940.920.90考马斯亮蓝G-250试剂（mL）555555蛋白质含量（μg）020406080100OD595nm（2）0~1000μg／mL标准曲线的制作：另取6支10mL具塞试管，按表2取样。其余步骤同（1）操作，做出蛋白质浓度为0~1000μg／mL的标准曲线。表2高浓度标准曲线制作管号7891011121000μg／mL标准蛋白液（mL）00.20.40.60.81.0蒸馏水（mL）1.000.80.60.40.20考马斯亮蓝G-250试剂（mL）555555蛋白质含量（μg）02004006008001000OD595nm2．样品提取液中蛋白质浓度的测定（1）待测样品制备：称取新鲜绿豆芽下胚轴2g放入研钵中，加2mL蒸馏水研磨成匀浆，转移到离心管中，再用6mL蒸馏水分次洗涤研钵，洗涤液收集于同一离心管中，放置0.5~1h以充分提取，然后在4000r/min离心20min，弃去沉淀，上清液转入10mL容量瓶，并以蒸馏水定容至刻度，即得待测样品提取液。（2）测定：另取2支10mL具塞试管，按下表取样。吸取提取液0.1mL（做一重复），放入具塞刻度试管中，加入5mL考马斯亮蓝G-250蛋白试剂，充分混合，放置2min后用1cm光径比色杯在595nm下比色，记录光密度OD595nm，并通过标准曲线查得待测样品提取液中蛋白质的含量X（μg）。以标准曲线1号试管做空白。表3待测液蛋白质浓度测定管号1314蛋白质待测样品提取液（mL）0.10.950.10.95蒸馏水（mL）考马斯亮蓝G-250试剂（mL）OD595nm蛋白质含量（μg）五、结果计算样品蛋白质含量（μg/g鲜重）=样品鲜重（g）X×提取液总体积（mL）测定时取样体积（mL）式中：X为在标准曲线上查得的蛋白质含量（μg）。六、注意事项1、牛奶与缓冲液要预热2、缓冲液要缓加缓搅3、在滤纸上样品的脱脂过程要搅动，不得搅破滤纸4、实验环境要保持空气流通，门窗要开5、酪蛋白等电点随温度不同而变化,等电点pH为4.6～4.8。分离酪蛋白时,边加醋酸边搅拌,边测pH,同时观察沉淀。开始快搅拌,接近等电点时,应慢搅拌。6、酪蛋白沉淀用200目的尼龙布过滤比较好,同时进行抽滤。用滤纸很难过滤;而用纱布过滤,酪蛋白容易粘在其上。7、用乙醇和乙醚清洗酪蛋白沉淀时,应将酪蛋白捣碎,并在溶剂中搅拌、浸泡,充分洗净脂肪。纯净的酪蛋白应为白色,若发黄表明脂肪未洗干净。七、思考题1.在酪蛋白制备时为什么要用醋酸缓冲液调pH到4.8？2.乙醚、乙醇作用是什么？10mL牛奶预热调pH至4.7室温冷却离心得沉淀于离心管内悬浮离心得沉淀于离心管内去脂肪漏斗过滤滤干洗涤洗涤（脂肪完毕）带滤纸烘干称重计算。40°C40°C预热的醋酸buffer10mL边加边搅拌5000r/min5min4mLH2O5000r/min5min20mL乙醇5min20mL乙醇微搅动20mL乙醇乙醚混合液（1:1）20mL乙醚60°C,4h