限制性核酸内切酶概要

限制性核酸内切酶于雪果树学1502011010概念•限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（一般4-8bp），并在此处切割DNA双链的核酸内切酶。•主要存在于原核生物，是原核生物自我保护的一种机制。发现和历史在本世纪中期，Arber等人对λ噬菌体在大肠杆菌不同菌株上的平板培养效应的研究为基础，发现了原核生物体内存在着寄主控制的限制和修饰系统。经过大量努力后，终于在1970年取得了突破，人们发现了在流感嗜血杆菌中存在一种酶，这个酶可以识别双链DNA分子中的一个特定靶序列，并在该序列之内切断多聚核苷酸链，从而产生长度和序列一定的分离片段。HamiltonSmith的发现，他从嗜血流感细菌菌株Rd中找到了一种限制性内切酶，并阐明了它在噬菌体T7DNA中切割的核苷酸序列（Kelly&Smith，1970）。这个酶现在命名为HindⅡ。在发现HindⅡ后不久，又分离到其他几个Ⅱ型的限制性内切酶，并分析了它们的性质，EcoRⅠ是其中最重要的一个。它们随即迅速用于最初的重组DNA实验中。识别位点大多数的Ⅱ型限制性内切酶，都能识别4~8个核苷酸组成的特定的核苷酸序列。这样的序列称为核酸内切限制酶的识别序列。切割位点的共同特点是具有双重旋转对称的结构形式，就是指这些核苷酸对的顺序是呈回文结构的。例如：EcoRI识别GAATTC切割类型粘性末端：两条链上的断裂位置是交错的，但又对称的围绕着一个对称轴排列。平末端：两条链的断裂位置是一个对称的结构。平末端的DNA片段不容易重新环化。至少存在4种不同类型的R-M系统：类型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ。它们之间的主要差异总结在表3.1中。分类是一类兼有限制性内切酶和修饰酶活性的多亚基蛋白复合体。它们可在远离识别位点处任意切割DNA链。不能产生确定的限制片段和明确的凝胶电泳条带，因而不具备实用性。Ⅰ型限制性内切酶Ⅲ型限制性内切酶也是一类较大的兼有限制-修饰两种功能的酶。它们在识别位点之外切开DNA链，并且要求同一DNA分子中存在两个反向的识别序列以完成切割。这类酶很少能达到完全切割。Ⅳ型限制性内切酶识别经典甲基化的和修饰的DNA。以E.coli的McrBC和Mrr系统为代表。Ⅱ型限制性内切酶1.能在其识别序列内部或附近特异地切开DNA链。它们产生确定的限制性片段和凝胶电泳条带，因此是唯一一类用于DNA分析和克隆的限制性内切酶。2.Ⅱ型限制性内切酶由一群性状和来源都不尽相同的蛋白组成，因而它们的氨基酸序列可能截然不同。3.它们一般以同源二聚体的形式结合到DNA上，识别对称序列；最常见的Ⅱ型限制性内切酶1.在特异性识别序列内部切割DNA，如HhaI、HindIII。它们一般以同源二聚体的形式结合到DNA上，识别对称序列；2.但也有少量的酶与DNA结合形成异二聚体，识别非对称序列（如BbvCI识别CCTCAGC）。3.一些酶识别连续性序列（如EcoRI识别GAATTC，其中的两个半识别序列是相连的）；4.而另一些识别非连续性序列（如BglI识别CCNNNNNGGC，其中的两个半识别序列是不相连的）。另一种比较常见的Ⅱ型限制性内切酶•ⅡS型酶，如FokI，它们在识别位点之外切开DNA。这些酶大小居中，约400-650个氨基酸，由DNA结合域和切割DNA的功能域组成。它们识别连续的非对称序列。•一般认为这些酶主要以单体的形式结合到DNA上，与邻近酶分子的切割功能域结合成二聚体，协同切开DNA链。FokI条件•只有当镁离子存在时，它们才有切割活性，相应的修饰酶则需要S-腺苷甲硫氨酸的存在。•限制性内切酶切割后产生一个3'-羟基和一个5'-磷酸基。•属名的头一个字母和种名的头两个字母表示寄主菌的物种名称，如果一种寄主菌株具有几个不同的限制与修饰体系，以罗马数字表示。限制性内切酶命名同裂酶识别相同序列，但切割位点不同的酶，例如SmaⅠ（CCC/GGG）和XmaⅠ（C/CCGGG），称为新裂酶。新裂酶具有相同的序列特异性和切割位点的限制酶称为同裂酶。虽然来源各异，识别的靶序列也各不相同，但都产生出相同的粘性末端。同尾酶酶的星号活性在极端的条件下（如高pH和低离子强度下），限制性内切酶可以切割类似但不同于其特定识别序列的序列，这种改变的特异性称为星号活性。如EcoRⅠ切割GAATTC，但EcoRⅠ星号活性切割序列N/AATTN影响限制性内切酶活性的因素1、DNA的纯度2、DNA的甲基化3、温度4、DNA的分子结构5、限制酶的缓冲液限制性内切酶反应的终止消化DNA样品后，为进一步处理DNA要钝化内切酶的活性，钝化大多数限制性内切酶的方法是65℃温浴5分钟。有些需要加入EDTA。完成后进行凝胶电泳应用•DNA重组•限制酶（物理）图谱绘制•突变分析（RFLP分析）•限制酶的部分酶切与完全酶切