医药领域的革命

医药领域的革命——基因治疗卢大儒复旦大学遗传学研究所•世界首富：比尔.盖•茨预言：超过他的•下一个世界首富必定•出自基因领域。基因是什么？基因是生命的密码基因记录和传递遗传信息基因决定生物体的生、长、病、老、死等一切生命现象UnitedGeneUnitedGene基因是染色体上的一段DNA染色体基因1基因2基因与疾病•基因与人类的疾病密切相关,遗传病是由于基因先天缺陷所致;肿瘤的发生涉及多种基因改变,包括癌基因激活或抑癌基因失活;高血压,糖尿病等多基因病也涉及到多种基因的改变;由病原体所致的传染病也和人体基因密切相关,存在易感人群和耐受人群.基因是生物医药产业的源头基因基因诊断基因治疗反义RNA免疫学诊断基因工程药物化学合成药物设计的靶分子DNA疫苗或核酶等基因治疗-新的医学革命•*基因治疗是最彻底的治疗,分子外科。•*基因治疗是把药物工厂开到人体里去，在需要的时候就生产药物，不需要的时候自动关闭。•*基因药物是继公共卫生,麻醉术,抗菌素和疫苗以后的医药工业的第四次革命，它将成为医药工业的发展趋势。••基因治疗-新的医学革命•基本概念:将正常有功能的基因导•入人体,以基因作为药物治疗疾病.•与传统治疗区别:•基因治疗的特异性:针对性强;•药物本质为DNA;DNA在人体细胞•内表达成为蛋白质;•**基因治疗作用的持续性.图1普通药物治疗药物动力学曲线药物需要不断给予,才能维持有效浓度,,药物浓度不断变化,或无效,或生副作用.图2.基因治疗药物动力学曲线基因治疗只要1次给药,蛋白表达量逐渐上升,几乎恒定不变.基因治疗的基本原理基因治疗什么病?•遗传病:基因先天缺陷,理论上疾病治疗的希望根本所在;如隐性单基因遗传病.•肿瘤:为肿瘤治疗提供了一条新路,发展迅速,具有潜在的商业价值•传染病:艾滋病,肝炎等疾病的治疗•一种新的尝试.•其他疾病:心脑血管疾病,神经系•统退行性疾病,不妨一试,意外效果.基因治疗-从治疗到预防•基因治疗不仅可以用于疾病的治疗,还可以用于疾病的预防.•传染病的预防:基因免疫(DNA疫苗),肝炎,肺结核,腹泻,流感等;HIV预防•肿瘤预防:鼻咽癌,宫颈癌病毒导致肿瘤等;•肿瘤复发预防:各种基因转移肿瘤瘤苗免疫基因治疗--从治疗到提高•基因治疗不仅可以用于疾病的治疗和预防,还可以用于人类生活质量的提高和改善.•1.肥胖,秃顶患者的福音•2.长命百岁不再难求•3.耳聪目明易如反掌•4.性格重塑随心所欲•问题焦点:基因治疗的伦理学的挑战基因治疗的限定范围•理论上,基因治疗可以从基因层次上彻底治疗遗传性疾病,改善人的体质.但是,目前基因治疗严格局限在体细胞,不允许对生殖细胞(卵细胞和精子)进行基因改造,即基因治疗限制在当代,而不能影响下一代.另外一方面,基因治疗在提高人的体质方面存在一定的争议,如给正常人进行增高的基因治疗,基因兴奋剂.基因治疗的策略•缺陷基因的修补:基因哪里坏了修补哪里,完美无缺,不留痕迹.•缺陷基因的补充:基因坏了,增加一条好的基因进行代偿.好比交通堵塞,另外开辟一条新路.•缺陷基因的关闭:抑制缺陷有害基因表达.如肿瘤基因,显性遗传病等.•全新基因导入:为了达到预防和治疗疾病的目的,将人体原本不存在的基因引入.•DNA片段:不是基因,不产生蛋白产物,但是可以抑制基因表达.反义ODN,反义RNA,核酶等.•*基因调控治疗:根据基因代谢通路进行上中下调节.基因定点修复和基因替补基因治疗的途径•1.exvivo途径:将人体细胞从体内取出,基因改造,再移植到人体中.自体,同种异体,异种细胞,同种异体或异种组织和器官等.•2.invivo途径:直接将基因转移到人体中,如DNA注射,口服,喷雾等.有如普通治疗药物,商业化发展方向所在.基因治疗的exvivo途径基因治疗就向打针和吃药一样.基因治疗的invivo途径基因治疗的靶细胞/器官•1.基因缺陷的细胞:如受体缺陷细胞,肿瘤细胞等,原位细胞.•2.广泛的细胞类型:基因产物进入血液•干细胞:包括骨髓,脐血和外周血干细胞•皮肤:成纤维细胞,上皮细胞•血液:淋巴细胞•肌肉:成肌细胞和肌小管•肝脏:肝细胞•口腔:涎腺细胞基因治疗--三大要素•1.基因转移系统•2.基因表达调控•3.治疗相关基因基因治疗的“枪炮”---基因转移系统•1.物理方法:基因枪;基因针,基因缝线;DNA•直接注射;电穿孔,射频电穿孔•超声导入.•2.化学方法:磷酸钙;脂质体,多聚赖氨酸等•3.生物方法:反转录病毒;腺病毒;腺相关病•毒;单纯疱疹病毒;细小病毒;•沙门氏细菌,厌氧细菌基因转移物理化学方法评价•物理化学方法用基因转移取得了长足的进步,效率不断提高,安全可靠,已经广泛用于临床试验,代表了基因治疗未来的发展方向.但是需解决以下问题:•1.基因转移的效率和稳定性;•2.基因表达的持续性;•3.基因转移的靶向性;•基因转移的生物学途径•人类设想基因转移最初从病毒感染人体而来,希望将有害的病毒进行改造,用目的基因替换有害基因为人类治病.病毒介导的基因转移是目前最为成熟的方法,面临最大的问题是安全性,尤其是长期安全性.不同的病毒载体需要解决不同的问题.•主要包括:基因转移的效率,稳定性,遗传毒性,免疫反应,表达时间,转移的靶向性,目的基因的装载容量等.•RVAVAAVHSV•基因组成ssRNAdsDNAssDNAdsDNA•基因组长度10kb36kb5kb152kb•装载容量8kb8kb4.5kb30kb•病毒滴度1071011108108•感染细胞谱窄宽宽窄•感染能力中很强强强•整合能力有无有无•毒性作用遗传毒细胞毒遗传毒细胞毒•免疫原性弱中等弱强基因治疗病毒载体比较反转录病毒载体(RV)RV为单链RNA病毒.1.Murineleukemiavirus,MLV结构:重组病毒制备原理:反式互补研究问题:安全性;滴度和感染效率;合适的靶细胞安全性研究1.辅助细胞的制备:多次同源重组PA317;PG132.反转录病毒载体:减少同源;起始码突变N2,LN系列;G1Na系列;3.具有复制能力的RCR的检测:S+/L-;补救分析;RT-PCR4.病毒的插入致癌作用:•1.病毒滴度的提高:•VSV-G蛋白包装;低温培养方法•2.病毒的感染效率:•磷酸钙沉淀;•流动感染•离心感染病毒的滴度和感染效率病毒感染的靶向性•1.病毒感染靶向性原理:env膜蛋白•嗜双性辅助细胞:PA317•2.病毒的靶向性感染:•膜蛋白的基因置换•受体配体基因的置换•抗原-抗体基因的置换•优点:感染非分•裂细胞的RV•举例:HIV;SIV•RRE•结构:LTR-gag-pol--env--LTR•TARtat,rev,tev•应用:宿主广泛;干细胞,艾滋病基因治疗•问题:安全性,需要多次同源重组Lentivirus腺病毒载体双链DNA无包膜病毒.1.优点:易制备;高滴度;宿主广;高感染;低毒;安全;途径多,简便2.可能缺点:免疫原性;不整合3.第一代重组腺病毒293细胞:15%E1等AdDNA缺陷载体制备:E1缺陷;同源重组腺病毒载体基因治疗研究•1.遗传病基因治疗:CF;血友病B,A•局限性:短期表达;不能重复;炎症•2.肿瘤基因治疗:免疫反应;短期表达•广泛应用:多种基因,多种肿瘤•IL-2;MHC;P53;P21;FasL;IGF-I•HSV-TK,VEGF,Angiostatin•第二代腺病毒载体1.早期AVE1+E3区缺失的有限性2.E2,E4区的置换:Wilson报道:温度敏感E2突变AV降低免疫性,表达延长;未根本解决；制备293/E2A,293/E4细胞;相应载体;扩大容量;降低毒性和免疫性;效果有限;滴度下降.*293T细胞:转染SV40大T抗原降低腺病毒免疫原性•1.腺病毒载体插入B7反义基因,阻断共刺激途径;•2.腺病毒载体插入ICAM-1反义基因,阻断粘附因子作用.•3.腺病毒载体插入CTLA4基因,胞内结合B7.•4.腺病毒载体插入MHC-I,II基因的调控基因反义片段.增强腺病毒的感染效率•1.腺病毒与葡聚糖,聚凝胺,多聚赖氨酸,脂质体混合感染细胞,组织,提供感染效率10-100倍,降低炎症反应.•2.重组腺病毒感染前,进行腺病毒封闭•3.不同亚型腺病毒互换应用.辅助病毒策略1.野生Ad作为辅病毒替代293细胞优点:载体的容量扩大36kb缺点:病毒的纯化2.辅助病毒补充293细胞优点:载体的容量扩大缺点:混合病毒分离;利用Cre/loxP系统制备辅助病毒•辅助病毒5‘’ITR下游包装信号区域以及结构基因区域分别引入loxP顺序.同时制备293/cre产病毒辅助细胞,诱导Cre表达,从而控制辅助病毒的产生.•ITRloxPloxPITR微小腺病毒制备方法•1.直接构建30kb大小的质粒•困难:30kb大小载体构建复杂•2.同源重组制备微小腺病毒载体.••3.病毒载体首尾连接,重组载体•5’3’•5’3’5’微小腺病毒研究1.1996,Kochanek包装28kb的微小腺病毒2.1997,Alemany,包装容量研究,FVIII基因Baxter公司Dai,FVIII,血友病A小鼠研究3.1998,Schiedner包装AAT基因组DNA研究焦点:辅助病毒的设计:野生型E1缺失型包装缺陷型提高微小腺病毒的滴度:长度;顺式序列腺相关病毒(AAV)•结构:单链DNAITR-rep-cap-ITRAAV的优点:靶向整合,低免疫原性缺点:rep毒,制备困难容量有限应用:遗传病等基因治疗发展:解决rep,cap细胞系,AAV的大量制备;靶基因的拼接rAAVProductionPurification•GenetransfertoBHKcellsHelpervirusrHSVReleasevirus单纯疱疹病毒(HSV)•双链DNA有包膜病毒,包括:HSV-1,2,VZV,EB,CMV.主要以HSV-1型为主.•HSV载体含包装信号,复制位点等顺序结构,HSV病毒启动子,目的基因表达框架.由辅助病毒共转染补足细胞M64A,制备重组病毒.•HSV重组病毒另一种形式是复制子,不含有任何病毒结构基因.•辅助病毒的改造:IE3温度敏感突变型;•缺失突变型:IE3缺失;•应用:感染心肌细胞,神经元,神经胶质细胞.•VEGF---血管形成;脑肿瘤;帕金森病HSV-AAV系统•利用HSV作为辅助病毒,包装制备AAV病毒,开创了一种从病毒到病毒的简便的技术路线.•构建含有AAV-rep-cap基因的HSV载体,制备重组HSV病毒,感染带有AAV-载体的细胞,即可获得重组AAV病毒.微小AV-AAV系统•利用同源重组制备微小腺病毒,去除所有腺病毒结构基因;•利用AAV-ITR结构,促使微小腺病毒中AAV载体表达框架整合到宿主染色体中,长期表达.•AdITRAAVITRAAVITRAdITR细小病毒系列载体•1.H-1,MVM;LuIII等自主性细小病毒•ssDNA,5kb,非结构蛋白NS1,2;结构蛋白Vp1,2•野生型H-1对人特异性消化道肿瘤抑制生长;•重组病毒:细胞因子基因替换VP基因,增强细胞杀伤作用.•2.MVM,LuIII针对小鼠等肿瘤特异性作用痘苗病毒(VacciniaVirus)•VV为双链DNA有包膜病毒,结构复杂,基因组200kb,可以插入25kb容量,主要用于制备重组疫苗,传染病及肿瘤免疫,也用于肿瘤基因治疗.VV载体通过目的基因置换,转染细胞,分离重组病毒.细胞毒作用强,短期表达.猴多空病毒(SimianVirus40)•SV40病毒为双链DNA病毒,5kb,载体含有ori,包装信号,启动子,终止子等以及重组元件,SV40作为辅助病毒与载体共转染COS细胞.•改进:SV40膜蛋白的细胞抽提物在细胞外自我组装成假病毒.优点:安全,发展为非病毒系统.包装效率有待提高,短期表达.•应用:感染非分裂细胞,•例如MDR基因转移造血干细胞(95%)•HBsAg免疫嵌合/杂合病毒(chimericorhybridvector)•1.AV/RV:1997,FengMZ等制备成两种AV/RV病毒,高效感染靶细胞