转录水平检测AFP

荧光定量RT-PCR检测AFPmRNA基因表达方法01020304目录CONTENT实验目的实验原理实验步骤及可能结果荧光定量RT-PCR应用原发性肝细胞癌(HCC)严重威胁人类健康,由于肝癌细胞容易侵犯血管,易发生血行转移。定量检测AFPmRNA对于早期发现外周血的肝癌细胞、判断肝癌的复发转移、治疗效果及预后具有重要意义。RT-PCR是一种非常敏感的检测方法,但无论竞争RT-PCR还是内源性参比基因RT-PCR定量法,他们均属PCR终点检测法,在PCR扩增的指数期和平台期产量相差极大,很难对起始模板数准确定量。本实验运用荧光定量RT-PCR技术建立了定量检测肝癌细胞AFPmRNA基因表达水平的方法。一、实时荧光定量PCR（FQ-PCR）01荧光染料02荧光共振能量转移03PCR扩增及其监测04实时荧光定量PCR定量原理05实时荧光定量PCR优缺点荧光基团通常各有单一的的光吸收峰，荧光基团吸收激发光的能量后通常以3种方式释放出能量。（1）光能（2）热能（3）转移给邻近的分子01荧光染料当某个荧光基团的发射光谱与另一个荧光基团的吸收光谱发生重叠，且两个基团距离足够近时，能量可以从短波长（高能量）的荧光基团传递到长波长（低能量）的荧光基团，实际相当于将短波长荧光基团释放的荧光屏蔽（猝灭）。02荧光共振能量转移荧光PCR的独特之处在于PCR过程中利用荧光染料在激发光下释放的荧光能量的变化直接反应PCR扩增产物量的变化。由于荧光信号变量与扩增产物变量成正比，通过足够灵敏的自动化仪器对荧光进行采集和分析，能够实现对PCR过程的检测，达到对原始模板定量的目的，主要采用以下数种模式：03PCR扩增及其监测01仿溴乙錠着色监测02荧光标记引物03荧光标记探针荧光染料（如SYBRGreenI）直接嵌入扩增产物DNA双股螺旋链中，通过对特定方向的强荧光检测或的信号。这种模式能特异性地区分单链、双链DNA（只与双链DNA结合），缺点是已产生非特异信号，且本底较高。03PCR扩增及其监测01仿溴乙錠着色监测04实时荧光定量PCR定量原理1.几个基本概念01020304基线荧光阈值的设定Ct值05S型扩增曲线熔解曲线是指在PCR扩增反应的最初数个循环里，荧光信号变化不大。接近一条直线，这样的直线即是基线。一般将PCR反应前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号（本地信号是指没有进样时检测器的信号值，与检测器的类型有关，是无论如何也去不掉的值。测试的结果是在本底值之上增加多少的），荧光域值是PCR3—15个循环荧光信号标准差的10倍，荧光域值设定在PCR扩增的指数期。04实时荧光定量PCR定量原理基线荧光阈值的设定C代表循环数、t代表域值。Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数，而所涉阈值都很低。Ct值分析实际上就是低浓度的荧光值分析。由于是低浓度，影响因素小，误差没有被放大，所以具有良好的重现性。Ct值1.几个基本概念PCR过程中，以循环数为横坐标，以反应过程中实时荧光强度为纵坐标所作的曲线。S型扩增曲线1.几个基本概念04实时荧光定量PCR定量原理判断扩增曲线是否良好的指标主要有几个方面：●曲线拐点清楚，特别是低浓度样本指数期明显，扩增曲线整体平行性好，基面平而无上扬现象，低浓度样本扩增曲线指数期明显。●曲线指数期斜率与扩增效率成正比，斜率越大扩增效率越高。●标准的基线平直或略微下降，无明显的上扬趋势。●各管的扩增曲线平行型号，表明各反应管的扩增效率相近。S型扩增曲线对PCR产物加热，随着温度的升高，双链扩增产物逐渐解链，导致荧光强度下降，到达某一温度时，会导致大量的产物解链，荧光急剧下降。利用该特点以及不同PCR产物其Tm值的不同，因此使其荧光信号发生迅速下降的温度也不同，可通过此对PCR的特异性进行鉴定。熔解曲线04实时荧光定量PCR定量原理1.几个基本概念Ct与起始模板量的对数呈反比，即Y=-aX+b，其中X为浓度值对数值，Y为Ct值。PCR扩增包含定量对照，即引入一系列已知起始浓度的模板与未知样品同时进行扩增，配合使用PCR扩增与荧光检测合二为一的仪器，利用该系列模板Ct值与已知浓度对数作直线回归得到标准曲线，从而计算出位置样品的起始模板浓度。这种定量分析摒弃对PCR终产物的测定，通过监测PCR过程中荧光强度的连续变化，用准确表征PCR对数增长规律的Ct值进行循环实时分析。04实时荧光定量PCR定量原理2.标准曲线绘制固定循环数后，荧光信号与模板数成正比，但当固定荧光信号值后，模板数就与循环数呈反比。研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可做出标准曲线：横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值。因此，只要获得位置样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数（起始拷贝数就是指某基因(可以是质粒)在某一生物的基因组中的个数.单拷贝就是该基因在该生物基因组中只有一个,多则指有多个）。04实时荧光定量PCR定量原理2.标准曲线绘制荧光PCR融汇了PCR的灵敏性、DNA杂交的特异性和光谱技术的定量精确性，具有以下的优点：05实时荧光定量PCR优缺点优点1）封闭反应，直接探测PCR过程中的变化以获得定量的结果，污染因素少，且无需PCR后处理。2）灵敏度高，假阳性率低，荧光标记探针的最大优点在于其特异性非常强，避免了非特异性扩增造成的假阳性信号。3）采用对数期分析，摒弃终点数据，定量准确。7）操作安全快速4）定量范围宽，可达到10个数量级。5）计算机同步跟踪，数据化自动处理，在线实时监测，结果直观，避免人为判断。8）利与自动化和联网管理6）效率高，可用多种商品画荧光物质，如TET、FAM、HEX、JOE等作为报告荧光（3’端的猝灭基团常用TAMRA），实现一管双检或多检。扩增的循环数越靠后，定量的重复性越差，可能有以下主要原因：1)荧光定量技术要求在低分子浓度环境。因为荧光检测定量原理是在忽略分子间相互作用的情况下建立起来的。如果分子浓度过高，影响作用复杂，而PCR扩增产物时高浓度的，因此重复性变差也很容易理解。2)由于扩增末期，扩增效率可能因为大量的靶序列而产生不可控的影响。05实时荧光定量PCR优缺点缺点二、TaKaRaOneStepSYBRQRT-PCR试剂盒01制品内容原理：本制品利用反转录酶PrimeScriptRTase将RNA反转录成cDNA，在以cDNA为模板利用TaKaRaExTaqHS在同一反应管内连续进行RT-PCR扩增反应（利用SYBRGreenI嵌合荧光法）。采用如图所示的OneStepRT-PCR方法，反转录以总RNA为模板，利用反应引物合成cDNA，在以此为模板，利用引物进行PCR扩增反应。01制品原理应用生物信息学知识,从基因库中查阅出AFP的DNA和mRNA序列。根据引物设计原则,并利用PrimerExpress2.0设计软件,设计出扩增AFPmRNA基因片段的上下游引物和探针。PCR实验成功的最关键环节就是引物的设计。3引物、探针的设计和合成用上述提取的的总RNA,进行逆转录PCR。反应体系:主要包含上下游引物、各种酶、底物、模板和Mg2+5种物质。现在以TaKaRaOneStepSYBRQRT-PCR试剂盒为例作为整个反应体系。反应条件:针对不同的引物，设定最佳的退火温度是QRT-PCR反应顺利进行的关键。具体反应程序包括反转录、预变性、变形、退火、延伸等。所有过程的反应温度和作用时间均应经过筛选确定最佳反应条件。具体反应条件的参考值见表1，可在参考值范围内加减选择最佳条件。根据扩增片断长度,扩增产物用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳,在紫外灯下割取特异性的条带,用QIAquickGelExtractionKit(德国Qiagen公司)试剂盒（用于纯化DNA）进行纯化。4RT-PCR扩增AFPmRNA用RNaseFreedH2O（用于溶解难溶于水的RNA）将总RNA稀释到0.2μg/μl，作为浓度最高的模板（20,1号）。然后取11个容量为150μl的离心管（2~12号），分别加入10μlRNaseFreedH2O。从1号管中取10μl加到2号管中，稀释倍数为1。以此类推，如图所示，将1号主机2倍稀释成，2-1、2-2、2-3、2-4、2-5、2-6、2-7、2-8、2-9、2-10、2-11，用于标准曲线的制作。5标准曲线的制作将倍比稀释的总RNA作为QRT-PCR标准曲线的模板，应用确定的最佳反应条件，进行实时荧光定量PCR扩增，系统根据荧光值的变化规律生成标准动力学曲线、熔解曲线、和标准回归曲线。5标准曲线的制作熔解曲线上应该有且只有一个明显的峰，扩增产物的Tm值须非常均一，表明没有产生非特异性扩增产物及引物二聚体。5标准曲线的制作5标准曲线的制作制作出最后的标准曲线之后，就建立了检测AFP表达的方法。要检测细胞中AFP是否异常表达，即可选取待检测的细胞重复前面的步骤，最后通过电脑得出该细胞RNA的Ct值，在标准曲线上得出它的起始拷贝数，根据此数据来判断是否异常表达。6检测细胞AFP是否异常表达6实验出现的可能结果主要包括病原微生物检测、病原体检测、基因病诊断、传染病检测和病变检测等。分子生物学上RT-PCR应用相当广泛，包括基因转录检测（同一基因在不同组织的表达差异，如药物处理、物理处理、化学处理等），特定基因在不同时期的表达差异等。SNP分析及深入应用。临床、食品及环境应用分子生物学应用遗传学应用