基因工程制药

基因工程制药第一节概述第二节基因工程基本技术与策略第三节基因药物生产的基本过程第四节基因工程药物制造实例第一节概述一、基因工程建立的基础二、基因工程的相关概念及相关酶学三、基因工程技术所生产的药物四、基因工程制药的优点五、基因工程制药所使用的生物技术六、我国基因工程制药的进展七、基因工程制药生产的化学工艺学要求八、基因工程的发展一、基因工程建立的基础（一）、理论方面的三个重要的发现1.生物遗传物质—DNA的发现2.DNA双螺旋结构和半保留复制机理的建立1953年，沃森(Watson）和克里克（Crick）首次提出了DNA双螺旋结构和半保留复制机理。这一重大发现大大地促进了现代生物科学的发展。3.遗传信息传递方式的确立1966年，发现DNA连接酶。1970年Smith和Wilcox在流感嗜血杆菌中分离并纯化限制性内切酶HindШ，使DNA分子的切割成为可能。1979年，Bltimore和Temin领导的两个研究小组分别在各自的工作中发现了逆转录酶。（二）、技术上三个重要成果1.基因工程的工具酶1972年，美国斯坦福大学Berg研究小组利用限制性内切酶EcoRI和T4DNA连接酶成功地进行了首例体外基因重组实验。2.基因工程载体为了使DNA片段能在宿主细胞中得以扩增，须将其接到一个特定能够进行自我复制的载体分子上。Lederberg开始从事细菌性因子（F因子）研究。20世纪50-60年代，相继发现其他质粒，如抗药性基因（R因子）和大肠杆菌因子（CoE）。这些工作为基因工程载体系统的建立打下基础。3.基因的体外重组技术1973年，科恩（Cohen）等人用EcoRI内切酶处理大肠杆菌的抗四环素和抗青霉素及磺胺的质粒，并连接成一个新的重组质粒。将这种工程化的质粒转入大肠杆菌，在含有四环素和青霉素的平板中筛选重组菌落。同年，加利福尼亚的博耶（Boyer）也进行了类似的实验。重组子转化的成功标志着基因工程的诞生。基因工程（geneticengineering）是指在基因水平上，采用与工程设计十分类似的方法，按照人类的需要进行设计，然后按设计方案创建出具有某种新的性状的生物新品系，并能使之稳定地遗传给后代。（三）、基因工程的研究内容二、基因工程相关概念及基本工具1.克隆与克隆化克隆指同一副本或拷贝集合。从众多不同的分子群体中分离的某一感兴趣分子，经扩增产生很多相同分子集合，即为分子克隆。2.DNA克隆在体外外来遗传物质与载体DNA结合成具自我复制的DNA分子，通过转化或转染宿主细胞、筛选出转化子细胞，再扩增提取获得大量同一DNA分子，即DNA克隆又称重组DNA。（一）、基因工程的相关概念3.目的基因有时应用重组DNA技术的分离、获得某一感兴趣的基因或DNA序列，有时是为获得感兴趣基因的表达产物--蛋白质。4.基因载体也称克隆载体。这是为“携带”感兴趣的外源DNA、实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。其中，为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。可充当克隆载体的DNA分子有质粒DNA、噬菌体DNA和病毒DNA。克隆和进行基因操作需要对遗传物质进行剪切、修饰和连接，这些过程都是在工具酶的催化下完成的。按功能将工具酶分类，可分为剪切酶类、连接酶类和修饰酶类如下所示分子剪刀和分子针线（二）、基因工程的工具酶1.限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease,RE)(1)定义是一类由细菌产生的能专一识别和切割双链DNA中的特定碱基序列的核酸内切酶，简称限制酶或切割酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ与甲基化酶共同构成细菌的限制-修饰系统：限制外源DNA，保护自身DNA，稳定细菌遗传性状。(2)分类、作用Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技术中常用Ⅱ型）第一个字母取自产生该酶的细菌属名第一个字母，用大写；第二、第三个字母是该细菌种名的前两个字母，用小写；第四个字母代表菌株类型；如果菌株有几种酶，在代表菌株的字母后用罗马数字表示。(3)命名EcoRⅠ属种株序EscherichiacoliRY13株大肠杆菌RY13株的第一种酶(4)Ⅱ类酶识别序列特点——回文结构(palindrome)特异识别及切割48个bp长度且具有回文序列的DNA片断，主要产生3种末端结构：5ˊ－粘性末端3ˊ－粘性末端平端或钝端回文序列(palindrome)是指该部位的核苷酸序列呈180O反向重复;粘性末端(stickyend)是指经内切酶特异切割后产生的5ˊ－末端突出和3ˊ－末端突出的碱基序列相互间具有互补性。BamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口同尾酶有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端(compatibleend)。BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATCTAGGATCTA2.DNA聚合酶Ⅰ（全酶）E.ColiDNA聚合酶Ⅰ（DNApolⅠ）是一个具有3种酶活性的多功能性酶。包括：5ˊ→3ˊDNA聚合酶活性5ˊ→3ˊ核酸外切酶活性3ˊ→5ˊ核酸外切酶活性DNApolⅠ应用⑴常用来催化DNA缺口平移反应，制备高比活性DNA探针；⑵cDNA第二条链的合成；⑶对DNA3突出末端进行标记；⑷DNA序列分析。E.coliDNApol.Ⅰ催化缺口平移*T*T*T*TMg2+DNaseI5'3'3'5'3'5'5'3'3'5'5'3'3'5'5'3'3'5'dATP,dCTP,dGTP[-32P]dTTPE.coliDNAPOLI3.TaqDNA聚合酶(TaqDNApolymerase)作用特点1）TaqDNApol催化DNA合成的最适温度范围7075℃，2）95℃以上高温，半小时不失活，3）最适合用于聚合酶链反应（PCR）。4.逆转录酶特点逆转录酶是一个多功能性酶，至少具有以下3种酶活性：⑴以单链RNA为模板，催化合成cDNA单链⑵具有RNaseH活性，能水解RNA:DNA杂交链中的RNA⑶以DNA为模板，催化合成cDNA双链。逆转录酶的应用：⑴将mRNA逆转录成cDNA，构建cDNA文库；⑵补平和标记5ˊ-末端突出的DNA片段；⑶代替Klenow酶用于DNA序列分析；⑷制备杂交探针等。5.DNA聚合酶Ⅰ大片段——Klenow片段Klenow片段用途⑴补齐双链DNA的3ˊ末端；⑵用标记碱基补齐3ˊ末端；聚合酶KlenowDNA[-32P]dNTPα双链DNA粘端5'-外切酶Ⅲ变性+5'3'3'5'3'5'3'5'3'3'5'5'5'5'3'3'标记探针标记末端⑶用于cDNA克隆中第二股链的合成；⑷DNA序列分析。6.DNA连接酶(DNAligase)催化双链DNA中一条链的3’-OH与另一条链的5’-PO3H2形成磷酸二酯键，从而构成完整的DNA长链。DNA连接酶的用途（1）两个双链DNA片段连接起来5ˊ-ACGAATTCGT-3ˊT4DNA连接酶5ˊ-ACGAATTCGT-3ˊ3ˊ-TGCTTAAGCA-5ˊ3ˊ-TGCTTAAGCA-5ˊ（2）修补带有缺口的双链DNA分子T4DNA连接酶7.碱性磷酸酶（alkalinephosphatase）能够催化水解去除DNA或RNA5’-端的磷酸基团。用途⒈制备载体时，用碱性磷酸酶处理去除载体分子5’－端磷酸基后，可防止载体自身环化连接，提高重组效率。⒉用32P标记5’-端前，去除5’-P，再通过激酶作用把放射性核苷酸加到5'-端进行标记。8.末端（脱氧核苷酸）转移酶(TdT)作用将标记或未标记的dNTP加到DNA的3’-OH末端；也可催化载体分子或待克隆的DNA片段上加上互补的同聚尾，便于进一步连接。应用①探针标记P32-α.dGTPG32G32G32G32G32G32G32G32②在载体和待克隆的片段上形成同聚物尾，以便于进行连接3´3´重要的工具酶工具酶活性限制性核酸内切酶（Ⅱ型）识别特异碱基序列，切割DNAT4DNA连接酶催化DNA5’-磷酸与3’-羟基形成磷酸二酯键DNA聚合酶以DNA为模板合成DNA逆转录酶以RNA为模板合成cDNA碱性磷酸酶切除5’-末端磷酸末端转移酶催化3’-端合成同聚尾基因工程的载体是为“携带”感兴趣的外源DNA、实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。（三）、基因工程的载体常用载体(vector)来源分类：质粒载体噬菌体载体病毒载体人工染色体载体用途分类：克隆载体表达载体穿梭载体克隆载体(cloningvector)能使插入的外源DNA序列被复制、扩增而不能表达，这样的载体为克隆载体。表达载体(expressionvector)使插入的外源DNA序列转录翻译，表达出多肽链，这样的载体称为表达载体。这类载体中含有来源不同的复制子结构，既具备原核细胞复制所需的序列结构，又具有能使外源片段在真核细胞表达所需的结构元件和相应的选择标记基因,故能在两种受体细胞中复制并检测，克隆的外源基因在此类载体直接从一种受体转入另一种受体中进行复制和表达．穿梭载体（shuttlevector)①具有能使外源DNA片段组入的克隆位点。②能携带外源DNA进入受体细胞，或游离在细胞质中进行自我复制，或整合到染色体DNA上随染色体DNA的复制而复制。③必须具有选择标记，承载外源DNA的载体进入受体细胞后，以便筛选克隆子。④分子量小，拷贝数高。⑤具有较高的遗传稳定性。基因克隆载体必须具备三个条件松弛型的复制子、多克隆位点、筛选标记.常见:质粒、噬菌体◆克隆载体必需结构:具有复制子，筛选标记，位于多克隆位点的上下游具有转录效率较高的启动子，起始密码子和核糖体结合位点，转录终止子结构．◆表达载体结构特点：三、基因工程技术所生产的药物传统方法很难生产的，主要是药用活性蛋白质和多肽类，包括：（1）免疫蛋白质----各种抗原、单克隆抗体、乙肝疫苗。（2）细胞因子----各种干扰素、白细胞介素、集落刺激生长因子、表皮生长因子、凝血因子、促红细胞生成素。（3）激素----胰岛素、生长激素、心钠素、人脑激素。（4）酶类----尿激酶、链激酶、葡聚糖酶、组织型纤维蛋白溶解酶原激活剂、超氧化物歧化酶、a-淀粉酶、凝乳酶、人溶菌酶、胰蛋白酶抑制剂。四、基因工程制药的优点（1）利用基因工程技术可以生产出过去难以获得的生理活性蛋白和多肽。（2）可以通过大批量的生产方法获得足够数量的生物活性物质。（3）利用基因工程技术可以发掘出更多的内源性生理活性物质。（4）利用基因工程技术和蛋白质工程技术可以对药物蛋白进行修饰和改造，来提高药效价值和获得新型的化合物。五、基因工程制药所使用的生物技术（1）DNA重组技术（2）淋巴细胞杂交瘤技术（3）细胞培养技术（4）克隆表达技术六、我国基因工程制药的进展α-1b型基因工程干扰素，是我国自行研究开发的具有国际先进水平的基因工程药物，于1997年通过III期临床，并获得国家一类新药证书。它源于中国人基因，最适于黄种人使用。目前，我国已经批准了12种基因工程药物和疫苗上市。七、基因工程制药生产的化学工艺学要求（1）工程菌大规模发酵工艺最佳参数的确立（2）新型生物反应器的研制（3）高效分离介质和装置的开发（4）分离纯化技术的优化控制（5）高纯度产品的制备技术（6）生物传感器等仪器仪表的设计和制造（7）电子计算机的智能优化控制八、基因工程的发展（一）基因工程的历史（二）基因工程所生产的产品（三）基因工程的发展方向（一）基因工程的历史1973年----Cohen第一例成功的克隆实验。1978年----Genentech公司生产出世界上第一种基因工程蛋白药物----人胰岛素。1982年----第一个基因工程药物重组人胰岛素在英、美获准使用。八十年代中期----PCR技术发明1985年----第一批转基因家畜（兔、猪和羊）培育成功。1999年9月-