基因芯片技术在耐药检测中的研究概况

1基因芯片技术在耐药检测中的研究概况马小林，李英伦(四川农业大学动物科技学院药理实验室雅安625014)摘要：基因芯片技术是近几年在国际上迅猛发展起来的一项高新技术，是生物技术与芯片技术相结合的产物。它在耐药检测研究中的应用将对耐药机制的研究、新的耐药基因的发现以及耐药个体化诊断具有极大的促进作用。关键词：基因芯片；耐药性；生物技术；病原微生物；耐药肿瘤ThefunctionofgenechiptechnologyinthemedicineexaminationMaxiao-lin，Liying-lun(CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，Pharmacologylaboratory，SichuanAgriculturalUniversity，Yaan625014，China)Abstract:Thegenechiptechnologyisaninternationalswiftandviolentdevelopmenthigh-techinrecentyears,itistheassociatedproductionofbiologicaltechnologyandthechiptechnology,ithastheenormouspromotinthestudyandresearchaboutdrugsresistanceandtheapplicationinthedrugsresistancemechanismresearch,thediscoverydrugsresistancenewlygene,aswellasthedrugsresistanceindividualdiagnosis.Keywords：Genechip；Drugsresistance；Technologyofbiology；Pathogenicmicroorganism；Bearsthemedicinetumor基因芯片技术是利用生物遗传法则，根据体内核酸中碱基配对、转录原理发展起来的一项新技术。至今，芯片技术已在医学领域中显示了其巨大的发展潜力并取得了一定的成功，为病原微生物的分子诊断技术提供了良好的发展前景。随着多种微生物全序列测定的完成，基因芯片技术的日臻完善，使基因芯片不仅能监测体外生长的细菌，而且可进行细菌的诊断、鉴别诊断、耐药性检测，亦可用于潜伏期或感染过程中的研究。本文就基因芯片在耐药检测中的应用和研究现状及其应用前景作一概述。1.基因芯片和基因芯片技术概述1.1概念基因芯片(genechip)，又称DNA微阵列(DNAmicroarray)，是近几年发展起来的一项前沿生物技术[1]。它是指通过光蚀刻、化学合成及微细加工工艺技术等方法，在很小的介质(如硅片、玻璃、尼龙膜等)表面合成，固定核酸、蛋白质及多肽序列形成高密度的点阵，与样品来源制备的探针杂交后，通过特殊的装置检测信号，并由计算机进行分析、综合，从而获得大量的生物信息，进行功能基因组的研究，更多地揭示基因之间表达变化的相互关系。其优势体现在快速、高效、高通量处理生物学信息的能力。基因芯片技术的开发始于90年代初期，其技术的发展得益于二项关键技术的发明，其一为非孔的固相支持介质，如玻璃片的使用，使微量和荧光检测技术的实现成为可能；其二是高密度原位合成寡核苷酸的方法，如Stevefoder研究小组采用半导体制作技术中的光路印刷屏蔽技术，生产高密度的寡核苷酸芯片，在仅20wm的玻片表面合成，固定达400000个寡核苷酸探针[2]。1.2分类基因芯片有多种分类方法，根据基因芯片的用途不同，可以分为表达芯片(expressionchip)、基因组芯片(genomicchip)和测序芯片(sequencingchip)；根据芯片上核苷酸的长度不同，可分为寡核苷酸芯片(oligo-chip)、cDNA芯片和基因组芯片。尽管分类方法有很多，但其制作过程不外乎二种，一是原位合成寡核苷酸制备芯片，二是将制备好的DNA片段排列到固相载体上。作者简介：马小林(1980-),男,四川泸州人,在读硕士,主要从事新兽药研究与开发。21.3应用1.3.1基因表达研究：主要方法是从不同来源的个体、组织，不同的细胞周期、细胞发育阶段及分化程度，不同的病变，各种刺激(包括不同诱导，不同治疗阶段)的细胞内的mRNA或逆转录为cDNA后，与表达谱基因芯片进行杂交，通过这些在不同条件的检测对象与正常对照之间的综合比较、分析和判断，同时进行成千上万个基因的研究，迅速而准确地将某些基因与疾病建立联系，同时明确这些基因功能及确立这些基因间内在的相互作用关系。1.3.2基因分型研究：通过与基因芯片杂交结果的分析，可以了解同一种疾病的不同基因变化情况。由于患者基因型的个体差异性，使治疗方案复杂化，而有了基因芯片确立患者的基因分型，可以帮助临床治疗方案个体化，这在白血病等疾患中表现得尤为突出及有价值。比如，许多形态学相似的白血病亚型和淋巴瘤，有相似的临床表现，造成了诊断困难，并因此可能引起治疗不当。有了基因芯片分型的帮助，可明确诊断，早期对症治疗，对延长病人的生存期、提高生存质量起到关键作用。1.3.3基因突变检测：Hacia等[3]证实，疾病的发生和发展与基因突变有密切关系，采用由96000个20bp的寡核苷酸探针组成的杂交芯片，完成了对遗传性乳腺癌和卵巢肿瘤基因BRCA1中的第ll外显子3．45kb上的24个异合突变的检测，共检测15例，发现其中14例有基因突变，包括点突变、插入、缺失等，而在20个对照样品中没有假阳性结果的出现。Afynetrix公司与Oncormed公司合作研究了专用于监测与肿瘤相关的P53基因全长的编码序列，发现50％以上的肿瘤患者有P53基因的突变，这对于肿瘤的早期发现、早期治疗意义重大。1.3.4DNA序列分析：芯片测序原理不同于传统的Maxam和Gibert的化学测序法及Sanger的末端终止法[4]，其原理为任何线状的单链DNA或RNA序列均可被分解为一系列碱基数固定，交叉重叠的寡核苷酸，依靠靶DNA片段与短的寡核苷酸探针杂交，通过重组交叉，重叠的寡核苷酸杂交谱，重建DNA序列。Mark等[5]利用不同的荧光标记，在一块固定有13500个寡核苷酸探针(每个探针长度为25个碱基)的硅片上对长度为16．6kb的人线粒体DNA进行序列的重复测定，准确率高达99％。2.基因芯片在病原微生物耐药性检测方面的应用基因芯片可用于病原微生物耐药基因的表达谱检测、突变分析、多态性的测定。病原体的耐药基因的检测可通过两种方式：表达谱芯片检测药物诱导的基因表达改变来分析其耐药性；寡核苷酸芯片检测基因组序列的亚型或突变位点从而分析其耐药性。美国Stanford大学的E．A．Winzeler等[6]，以两种不同菌株的酵母(S96和YJM789)作为实验材料，对控制酵母对放线菌酮的抗药发挥的基因进行分析。将含有酵母150000个DNA片断的基因芯片分别与这两株酵母活化转录的mRNA分子杂交，S96几乎全部吻合，而YJM789与芯片上的探针组存在较大的差异，约有3000个位点没有杂交显色。由于S96对放线菌酮有抗药性而YJM789的抗药性则弱得多，因此可以判定控制这一抗药性的基因的所在。而后，通过对S96和YJM789杂交后产生的抗药子代的遗传标记的分析，进一步确定控制该抗药性的基因位于15号染色体，是一长约57000个碱基的片断。目前已制备的耐药性基因探针如TMD耐药性基因、氨基糖苷类抗生素耐药性基因以в-内酰胺酶基因等均已使用于临床[7]。MichaelWilson等[8]使用包含有肺结核杆菌基因组PRF97％序列的基因芯片，对应用抗结核药物异烟肼诱导的前后表达的变化进行检测，结果证明肺结核杆菌中脂肪酸合成酶Ⅱ、fbpC、efpA、radii23、fadE24和ahpC基因发生的改变与耐药性有关。现在，结核杆菌耐药性检测芯片等一系列诊断芯片逐步开始进入市场。我国浙医一院传染病科俞云松、陈亚岗教授负责的科研小组检测到一种抗生素新耐药基因，世界基因库已将其正式命名为SHV28。只要在病人身上取血、尿或痰等标本进行检测，就可知道三代头孢类抗生素对治疗能否起作用。乙肝病毒(HBV)有较多亚型，HBV基因的多个位点如S，P及C基因区易发生变异。若用乙3肝病毒基因多态性检测芯片每隔一段时间检测一次，能指导用药，防止乙肝病毒耐药性很有意义。目前在肝炎的抗病毒治疗中产生的病毒耐药突变，最典型者为拉米夫定(3TC)抗HBV治疗中出现的YMDD变异。基因芯片针对引起YMDD变异的众多基因突变位点设计探针，将之结合于同一张芯片或与上述分型基因芯片合并，从血清样本中抽取病毒DNA，经体外扩增后与芯片探针杂交，依据杂交信号判定HBV的YMDD变异，得出是否产生耐药性的结论。现用于治疗AIDS的药物主要是病毒逆转录酶RT和蛋白酶PRO的抑制剂，但在用药3～l2个月后常出现耐药，其原因是RT、PRO基因产生一个或多个点突变[8]。RT基因四个常见突变位点是ASp67—Asn、Lys70—Arg、Thr215—Phe、Tyr和Lys219—Glu，四个位点均突变较单一位点突变后对药物的耐受能力成百倍增加。如将这些基因突变部位的全部序列构建为基因芯片，则可进行快速而有针对性的检测。3.基因芯片技术在疾病耐药性检测中的作用基因芯片技术对于疾病耐药性检测应用主要有以下几个方面。3.1多药耐药基因的表达检测肿瘤治疗中对细胞毒素药物的抗性是引起治疗失败的重要原因，是限制化疗的重要因素。机制是复杂的，由肿瘤的综合特征决定。另外，其他促进DNA修复和抑制细胞凋亡的基因表达改变也可能导致多药耐药。检测多药耐药基因表达的变化不但可以研究恶性肿瘤的不同耐药机制，还可以用于指导制定治疗方案。目前已建立的方法一次只能对一个基因进行研究．效率低，难以定量检测耐药基因表达增加的幅度。基因表达谱芯片可同时对成千上万的基因表达进行检测，可以大大加速这方面的研究。另外基因芯片还可以帮助发现新的耐药基因。3.2病原体耐药性检测多重耐药菌(MDR)感染在全球的状况十分严重。细菌对抗菌药物的耐药机制可有多种。采用基因芯片技术找到耐药菌的耐药基因。从而根据这些耐药基因设计新型抗生素．或将耐药菌分成不同的亚型。针对不同的亚型在临床上使用相应的抗生素．达到改善治疗效果的目的：检测耐药菌基因的改变．提供了新药物作用的靶目标，并指导抑制这些靶目标试剂和药物的合成。用基因芯片不仅可以同时检测耐药菌的多个耐药基因，还可以同时对多个耐药菌的多个耐药基因进行检测。3.3细菌耐药性检测耐药性又称抗药性，一般是指病原体的药物反应性降低的一种状态。这是由于长期应用抗菌药，病原体通过产生使药物失活的酶、改变原有代谢过程等，而产生的一种使药物效果降低的反应，因而作用的剂量要不断增加。对病原体耐药性的分子遗传学基础研究表明，细菌可通过不同机制产生遗传变异和对抗菌药物的改变。①微观的变化，在某一核苷酸碱基对中发生了点突变，导致抗菌药物作用靶位的改变，因而产生耐药性；②宏观的变化，导致DNA的一大片全部重排，包括倒位、复制、插入、中间缺失或细菌染色体DNA的大段序列从原来部位转座至另一部位，此种转座系通过一种特殊的遗传物质，即转座子或插入顺序来完成；③由质粒或噬菌体或其他遗传片段所携带的外来DNA片段，导致细菌产生耐药性。一般检测耐药性的方法有：药物敏感试验、质粒消除试验、质粒指纹图谱技术、基因探针、Southernblot，PCR，RT．PCR等方法，但是这些方法只能对少量样品进行分析，而基因芯片却可以克服此缺点，提高检测效率。基因芯片技术对于耐药基因的检测可从两个方面实现：一是通过基因表达谱芯片检测药物诱导基因表达的改变来分析其耐药性；二是寡核苷酸芯片检测基因组序列的亚型或突变位点来分析耐药性。4.基因芯片技术在耐药性检测中的应用和研究现状4.1利用基因芯片技术快速检测结核杆菌的耐药性结核病在全球的回升及耐药结核杆菌的出现，再次唤醒了人们的警觉，又重新将注