浅议血液筛查中的“漏检”

浅议血液筛查中的“漏检”与“灰区”问题血液筛查的终极目的筛查试验一、筛查的概念1957年WHO接受了美国慢性病委员会提出的关于筛查的定义：通过快速的筛查试验(screeningtest)和其他检查措施，在健康的人群中去发现那些未被识别的病人或有缺陷的人。筛查试验是从可能无患病者中查出外表健康而可能患病者。筛查不一定是诊断性的，阳性者或可疑阳性者应当指定就医，进一步诊断和进行必要的治疗。筛查与诊断的区别:1、应用目的不同诊断试验目的在于对受试者做出诊断，而筛查则是在受试人群中发现可疑患者或早期患者。2、应用对象不同通常诊断试验的应用对象是某病的可疑患者，即有一定的临床症状者，而筛查试验则是外表健康的人群，常用于高危人群。3、对两者的要求不同筛查时由于是在人群中应用，其中绝大多数是健康者，所以要求必须具备快速、简便、易行、廉价、安全、可靠、灵敏、能被受试者接受等特点。4、应用顺序不同筛查是第一步，诊断是第二步。临床诊断阳性阴性合计待评价阳性真阳性(a)假阳性(b)a+b试验阴性假阴性(c)真阴性(d)c+d合计a+cb+da+b+c+d临床实验方法学评价评价指标的计算：敏感度＝a/(a+c)特异度＝d/(b+d)阳性预测值＝a/(a+b)阴性预测值＝d+(b+d)诊断指数＝敏感度＋特异度诊断效率(准确度)＝(a+d)/(a+b+c+d)阳性似然比＝敏感度/(1－特异度)阴性似然比＝(1－敏感度)/特异度1、筛查：敏感性高，不落阳性者，可假阳性2、诊断：同时具备较好的敏感性和特异性3、确认：特异性好对于血站检验来说，主要是防止漏检。我国ELISA漏检情况远高于国外报道为什么？国家或地区HBVHCVHIV加拿大1:1530001:23000001:7800000法国1:6400001:100000001:3150000德国1:2300001:6700001:2770000日本1:519881:3480911:2668696美国1:1800001:2300001:1300000中国1：42781：406481：81296防漏检的策略•保证好的标本:标识正确，无交叉污染，标本离体后被分析物保持稳定，无干扰检测的物质。•好的检测方法：ALT和梅毒螺旋体的检测方法•好的设备：•好的试剂：新一代HIV、HCV检测试剂•好的分析操作：SOP问题、人员能力•好的质量控制：•正确的结果判读：理想的血液安全筛查方法应是病原的直接检测HBV------HBsAg[ELISA]HCV------抗HCV[ELISA]HIV------抗HIV[ELISA]梅毒螺旋体------梅毒抗体[RPR、TRUST、ELISA]ALT(速率法、赖氏法)EBV------寄生虫------WestNile------……•目前的检测几乎都是间接指标ELISA漏检的方法学因素灵敏度亚型和变异静默感染窗口期ELISA漏检•窗口期问题•灵敏度•亚型或变异问题•静默感染高危人群献血漏检风险更大常见的ELISA漏检因素•漏检是绝对的，不漏检是相对的–方法学、生理病理情况等都能引起漏检•窗口期是漏检最重要的因素–90%的HBV、HIV；70%的HCV（美国研究）•变异与亚型是漏检的重要因素–不同的试剂存在着不同的亚型适应性–对不同的亚型灵敏度也存在差异•静默感染是难以避免的问题–针对抗体为检测的ELISA项目•灵敏度是漏检不可忽视的因素–灵敏度是检出率的重要因素•实验错误再所难免–在现实工作中，从大面积和长时间的角度来看错误不能杜绝防漏检，保安全——献血者健康状况的综合评估策略？•基本社会背景•健康背景：既往史与现症史•体格检查•实验室指标的综合运用：以往与现在上述信息支持下的综合评估医疗纠纷风险——医院输血前后检查存在的问题•是否存在输血前检查假阴性问题？•出现纠纷后，血站需要自证清白——血站规范化管理的重要性和紧迫性——血站还应有主动保证血液安全的义务防漏检的技术问题一、一步法还是二步法？二、温育：1、试剂是否预温？2、确保温度均一性：边沿效应、空调风3、确保恰当的温育时间（所有孔均达到要求温度后开始计时）三、显色：血站检测的显色时间是否可比医院检测稍延长？四、比色：1、波长是否准确？2、检测光亮度是否合适？3、双波长优于单波长；4、检测线性范围，OD值低限区是否敏感？5、比色检测后的人工复核？五、发现加样环节出现的问题:吸量不足六、试剂问题：可通过质控结果反映七、存在干扰因素导致的弱反应：稀释后检测八、灰区问题ELISA是一种定性测定,通常用“反应性或阳性”,或“非反应性或阴性”方式报告结果,在阳性与阴性之间必须有一个明确的分界线,即阳性判断值(Cutoff值,CO值)。实际上,在临床测定所有标本中均要分出明显的阳性或阴性是不可能的,在它们之间还有弱反应性,此即为“灰区”。对“灰区”样本进行再确认是血站对血液安全高度负责任的体现1、S/CO≥1的样本还有假阳性。美国疾病预防控制中心曾对美国Ortho的抗-HCV检测ELISA试剂盒进行一个多中心研究,发现只有检测结果才有95%以上的初筛检测为反应性标本是真正的阳性；2、S/CO1者判为阴性在临床上完全可以接受；3、对S/CO1者“精益求精”是血站对血液安全高度负责任的表现。为什么血站要重视灰区的再甄别？1、灰区里还有阳性标本，轻易放过可导致受血者染病。解放军第159医院文进等将21例复查为灰区的标本（0.7s/co0.99），经解放军艾滋病检测确认实验室WB试验确认7例阳性。————临床输血与检验2005年4月第7卷第2期南京血液中心徐树良等，《中国输血杂志》2003，V16（1）初筛检测：HBsAgELISAFQ-PCR：HBV-DNA灰区：0.7s/co0.99江苏省临检中心许斌等，《临床检验杂志》1998为什么血站要重视灰区的再甄别？2、高危人群献血率增加，漏检或窗口期概率增大———新时期血液安全的挑战湖南邵阳市戒毒中心钱雪归等，对51份抗-HCVELISA检测0.75≤S/CO1.0的吸毒者血标本进行PCR检测，13例阳性。——吸毒人群抗-HCVELISA法“灰区”分析及其确认意义，实用医技杂志，2008年10月第15卷第29期“灰区”范围界定1、考虑到试剂批间差、板间差和操作误差，灰区设置应基于各实验室常规条件下的变异来确定；2、结合历史经验：在实验条件未改变的情况下，可暂定一个灰区范围，一段时间后分析回顾灰区样本的复检情况，研究决定调整灰区设定范围。（1）多少比例的漏检率是可以接受的？应以国家或政府的意思为依据（2）考虑复检在试剂和人力方面的花费，条件好时扩大复检范围；（3）以最佳付出/回报比例考虑引起“灰区”结果的原因1定性ELISA试剂盒CO值设定2试剂因素：部分市售KIT在包被抗原（或抗体）组成、包被工艺及包被板质量等方面存在孔间、批间、不同厂家之间的差异。3标本因素：（1）标本中被检物含量较低：免疫抑制药会降低抗体滴度（2）被检物含量太高———HOOK效应（3）抗凝不好的血浆或短期内采集的凝血不彻底的血清（4）内源性和外源性干扰因素。内源性干扰因素有类风湿因子、补体、高浓度的非特异性免疫球蛋白、异嗜性抗体和某些自身抗体等；外源性干扰因素有标本溶血、标本被细菌污染等。4操作因素的影响ELISA操作步骤复杂，每一步操作不当都会对结果产生影响。如加样引起的非特异性吸附，标本间互相污染，洗板次数不够或过多而引起假阳性或假阴性等。灰区样本复检不是简单重做•应认真查看标本状态：有无血液凝固不佳？有无溶血脂血？有无其他可能干扰了检测？•复检宜使用两种不同原理（或不同厂家）试剂，复检要遵循双孔复检原则•复检同样要严格质控•只有经复检后完全消除了疑问的，才能放行建议：1、应有额外的标本稀释后检测：减少抑制因素的影响2、应采用更灵敏、特异的方法来复查，以增加对标本的差别佐证条件具备时应及时使用更好的试剂做血筛•临床测定技术的发展主要在于方法学的发展，而方法学的发展依托于试剂生产技术不断进步更新和型标记物的应用。•HCV基因组有7个功能区组成：C、E1、E2/NS1NS2NS3NS4NS5(有分为NS5a和NS5b)区。目前用于检测的抗原几乎均是通过基因工程方法得到的。由美国ortho公司克隆C1003抗原几个片断与人超氧化物歧化酶（SOD）结合。用酵母从病毒基因组非结合区得到表达，表达为融合蛋白，亦作为包被固相载体。•抗原组合：NS4区二个基因片断为NS5-1-1和C1003•特性：IgG抗C100在发病后数月后，才检出，故不宜作早期诊断。•约由20%的病人不出现抗体。IgM抗-C100急性期检出率只有64%。•C100的抗原性较弱，在HCV复制中，不能充分暴露宿主的免疫系统。•特异性和灵敏性较差。第一代抗HCV-ELISA试剂盒第二代HCV-ELISA试剂盒•用基因重组的HCV结构蛋白与非结构蛋白抗原包被固相载体。•抗原组合：核心区（C区）多肽C22NS区多肽C33C1003和NS5-1-1•增加C22区和C33区后，抗体出现早，有助早期诊断，提高阳性率。有利早期诊断。•C22是早期易出现病毒血症第三代HCV-ELISA试剂盒•人工合成多肽抗原，由36个氨基酸组成的Cp9(内壳蛋白)和19个氨基酸组成Cp10混合包被固相载体。•抗原组合：除有C100-3C22C33外又增加了core和NS3NS4NS5•特点：*coreNS3NS5由Baculovirus重组表达，没有非特异性的载体，试剂特异性高，重组的蛋白经融合形成大分子抗原，利于提高检测灵敏度。*NS3区增加了氨基酸片断（比例十分重要）。改进了反映的灵敏度。*NS5经优化，徐去了非特异性的区域（G-D-D）NS3NS5是血转化最早测得的抗体，提高了诊断的准确性。*NS4为俩个片断的合成多肽，去掉了非特异性反应的区域，加强了试剂的灵敏度和特异性。第四代HCV—ELISA试剂盒•美国新近推出一种包括HCV基因组7个功能区所有免疫决定基的单一融合蛋白，称为多决定基融合抗原，采用表面活性剂处理分界病毒表面复合物，释放HCV核心抗原（core）并用ELISA法，灵敏度可达500拷贝/ml，已接近核酸扩增检测水平。•抗原组合：以Core和NS3作为主要检测片断（比例十分重要）加合成多肽NS4•特点：直接测Core抗原不易发生变异抗IgM和IgG检出率可达100%特异性达99.8%灵敏度为100%HIV检测试剂•通常情况下，病毒分离培养和PCR法检测HIVRNA的“窗口期”约为7天左右；检测P24抗原的“窗口期”约为14-21天；检测抗体的“窗口期”约为31-60天。尽量缩短“窗口期”，提高检测方法的灵敏度对于HIV感染的早期诊断，特别是在献血员的筛查，防止病毒传播方面具有重要意义。目前许多试剂商已推出能同时检出HIV抗原和抗体的第四代诊断试剂，可考虑推广应用。HIV抗体测定HIV抗体试剂盒进展代次抗原方法检测时间1全病毒间接2个月2重组或多肽间接3-4周3重组+多肽夹心4-7天4抗原+抗体夹心抗原5pgHIV抗体测定特点第一代全病毒HIV-1型第二代重组/蛋白/多肽联合HIV-2型敏感度同第一代，特异度提高第三代重组/蛋白/多肽间接法改为直接法除IgG外能检出早期IgM,缩短窗口期第四代HIV抗体试剂的特点•抗原抗体联合检测不能取代血液单个抗原的筛查（前者抗原检测范围20-100pg/ml，后者3.5-15pg/ml），增加假阴性•在急性感染期单一P24测定较第四代试剂检出早1-2天•第四代试剂在HIV-1非B亚型、O型和HIV-2的敏感度差异较大•由于加入检测抗原的抗-24抗体可减少单一第三代HIV抗体试剂的敏感度•可能会增加非特异性反应的危险性（第三代假阳性率0.2%增至0.3%-0.8%）•在检测程序上凡第四代阳性，要进行抗原的证实试验•核酸测定比抗体提前11天•BernardWebur首先评估了第四代试剂平均减少4天窗口期HIV初筛检测中值得注意的问题1、初筛检测的阳性结果不是最终结论。不能通知受检者本人及其他人员，阳性样本复检，复检仍为