实验课-制药工程生化原理与制备实验指

生化技术理论与实践实验指导（四年制制药工程专业）生命科学与工程学院制药工程系张新国编写二零一零年六月生化理论与实践实验指导1实验一管碟法测定抗生素效价一实验目的·了解管碟法的原理。·掌握二剂量法测定抗生素效价单位的技术和计算方法。二实验原理抗生素效价：抗生素是一种生理活性物质，它对生命现象很敏感，可以用抗生素的生物效能表示它的效价，其最小效价单元就叫做“单位”(U)。经由国际协商规定出来的标准单位，称为“国际单位”(IU)。通常各种抗生素的单位，是根据国家抗生素标准品测定出来的，是衡量药物有效成份的一种尺度。抗生素的剂量常用重量和效价来表示。化学合成和半合成的抗菌药物都以重量表示，生物合成的抗生素以效价表示，并同时注明与效价相对应的重量。效价是以抗菌效能(活性部分)作为衡量的标准，因此，效价的高低是衡量抗生素质量的相对标准。效价以“单位”(U)来表示。抗生素的生物检定是以抗生素对微生物的抗菌效力作为效价的衡量标准，具有与应用原理相一致、用量少和灵敏度高等优点。管碟法是琼脂扩散法中的一种，已被各国药典广泛采用，作为法定的抗生素生物检定方法。管碟法是根据抗生素在琼脂平板培养基中的扩散渗透作用，比较标准品和检品两者对试验菌的抑菌圈大小来测定供试品的效价。管碟法的基本原理是在含有高度敏感性试验菌的琼脂平板上放置小钢管（内径6.0±0.lmm，外径8.0±0.lmm，高10±0.lmm），管内放人标准品和检品的溶液，经16~18小时恒温培养，抗生素扩散的有效范围内则产生透明的无菌生长的区域，常呈圆形，称为抑菌圈（图实验-18）。抑菌圈直径大小与抗生素浓度相关，比较抗生素标准品与检品的抑菌圈大小，可计算出抗生素的效价。抗生素效价常采用二剂量法。将抗生素标准品和供试品各稀释成一定浓度比例（2:1或4:1）的两种溶液，在同一平板上比较其抗药活性，再根据抗生素浓度对数和抑菌圈直径成直线关系的原理来计算供试品效价。取含菌层的双层平板培养基，每个平板表面放置4个小钢管，管内分别放入检品高、低剂量和标准品高、低剂量溶液。先测量出四点的抑菌圈直径，按下列公式计算出检品的效价。(1)求出W和V：生化理论与实践实验指导2(2)W=（SH+UH）-（SL+UL）(3)V=（UH+UL）-（SH+SL）式中：UH：供试品高剂量之抑菌圈直径UL：供试品低剂量之抑菌圈直径SH：标准品高剂量之抑菌圈直径SL：标准品低剂量之抑菌圈直径求出θ：（2）θ=D·antilog（IV/W）式中：θ：供试品和标准品的效价比D：标准品高剂量与供试品高剂量之比，一般为1I：高低剂量之比的对数，即log2或log4。求出Pr：(5)Pr=Ar×θ式中：Pr：供试品实际单位数Ar：供试品标示量或估计单位当抗生素在菌层培养基中扩散时，会形成抗生素浓度由高到低的自然梯度，即扩散中心浓度高而边缘浓度低。因此，当抗生素浓度达到或高于MIC（最低抑制浓度）时，试验菌就被抑制而不能繁殖，从而呈现透明的抑菌圈。根据扩散定律的推导，抗生素总量的对数值与抑菌圈直径的平方成线性关系。三实验材料-材料和仪器（1）细菌：短小芽胞杆菌[CMCC（B）63202的芽胞悬液。（2）培养基：效价检定用培养基（上层、底层）。（3）抗生素：抗生素检品及标准品（高剂量、低剂量，高剂量与低剂量之比为2:1）。（4）试剂与器材：灭菌生理盐水，无菌平皿，牛津杯，无菌吸管，镊子，滴管，直尺。四实验方法（1）取无菌平皿，加入20ml底层培养基，凝固后作为底层。（2）用灭菌生理盐水将短小芽胞杆菌的芽胞悬液稀释至一定浓度以能得到清晰的抑菌圈，且标准品高浓度所得抑菌圈直径在18-22mm为基准。用无菌吸管吸取1ml芽胞悬液，加入到200ml恒温于50℃的上层培养基中摇匀，迅速以无菌吸管吸取5ml，注入到底层培养基上，铺平待凝。（3）在平板底部四边，分别对角注明“SH”、“SL”和“UH”、“UL”标记。生化理论与实践实验指导3（4）镊子火焰灭菌3次，然后夹取4个牛津杯垂直放置在平板中标志附近（注：勿使钢管陷入培养基内，各小杯之间尽量等距）。（5）以无菌滴管分别在每个牛津杯内加入相应的抗生素溶液至满但不溢出管外，且四杯内液面高度相同，盖上平皿盖，静置30分钟。（6）将平皿置于37℃恒温培养箱培养16-18h，量取各抑菌圈直径（SH、SL、UH、UL），以毫米为单位，误差不超过0.1mm。（7）计算抗生素效价（8）查放线图计算抗生素效价思考题怎样理解抗生素效价测定与抗生素含量测定二者的关系？生化理论与实践实验指导4实验二SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量一、目的1．学习SDS—PAGE测定蛋白质分子量的原理。2．掌握SDS—PAGE测定蛋白质分子量的操作方法。二、原理聚丙烯酰胺凝胶是由单体—丙烯酰胺（acrylamide,简称Acr）和交联剂-N,N-甲叉双丙烯酰胺（methylene-bisacrylamide,简称Bis）在加速剂和催化剂的作用下聚合而成的高分子物质，具有三维网状结构和分子筛性质。以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamidegelelectrophoresis,简称PAGE）。由于各种蛋白质所带的净电荷、分子量大小和形状不同，在电泳中会产生不同的电荷效应和分子筛效应，不连续电泳还有浓缩效应，因而有不同的迁移率。聚丙烯酰胺凝胶由于富含酰胺基，故它是稳定的亲水凝胶。结构中不带电荷，因而在电场中电泳电渗现象极为微小。网状结构能限制蛋白质大分子的扩散运动，具有良好的抗对流作用。在合适浓度范围内还具有较好的透明度，一定的机械强度，以及化学上惰性、吸附作用很小等许多优点。十二烷基硫酸钠（简称SDS）是阴离子表面活性剂，它在水溶液中，以单体和分子团的混合形式存在。单体SDS能与蛋白质结合生成蛋白质—SDS复合物。由于SDS带有大量负电荷，所以生成的蛋白质—SDS复合物所带的负电荷大大超过了天然蛋白质原有的电荷，因而消除或掩盖了不同种类蛋白质所带净电荷的差异，均带有相同密度的负电荷，。在蛋白质溶液中，加入SDS和巯基乙醇，巯基乙醇可使蛋白质分子中的二硫键还原，使多肽组分分成单个亚单位，SDS可使蛋白质亚单位中的氢键、疏水键打开，因此SDS与蛋白质结合后，还引起蛋白质构象的改变，蛋白质—SDS复合物形状近似雪茄形的长椭圆棒，不同复合物的短轴相同，约1.8nm，而长轴改变则与蛋白质的分子量成正比。基于上述两种情况，蛋白质—SDS复合物在凝胶电泳中的迁移率不再受原有电荷和形状的影响，而只是与椭圆棒的长度有关，也就是只与蛋白质分子量有关。在电泳体系中加入十二烷基硫酸钠（简称SDS），则电泳迁移率主要依赖于蛋白质分子量，而与所带的净电荷和形状无关，这种电泳方法称为SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）。蛋白质分子量在10，000—200，000之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系，可用下列公式表示：生化理论与实践实验指导5bmKMrlg上式中，rM为蛋白质分子量；K为常数；b为斜率；m为相对迁移率（即蛋白质的电泳迁移距离除以示踪染料迁移距离）。根据上述方程将已知分子量的标准蛋白质电泳迁移率与分子量的对数作图，可制作出一条标准曲线。在相同条件下只要测得未知分子量的蛋白质的电泳迁移率，即可从标准曲线求得其近似分子量。不同的凝胶浓度适用于不同的分子量范围（见下表1），可根据所测分子量的范围选择最适凝聚浓度，并尽可能选择分子量范围和性质与待测样品相近的蛋白质作标准蛋白。表1分子量范围与凝胶浓度的关系凝胶浓度交联度分子量范围5%2.6%25,000—200,00010%2.6%10,000—70,00015%2.6%10,000—50,000由于SDS—PAGE具有设备简单、快速，分辨率和灵敏度高等优点，广泛应用于生物化学、分子生物学、基因工程、医学及免疫学等方面。SDS—PAGE作为一种测定蛋白质分子量的方法，尽管对于大部分蛋白质来说，在比较广泛的分子量范围内，蛋白质的迁移率与其分子量的对数确实存在着线性关系，但是有许多蛋白质是由亚基或两条以上肽链组成的（如血红蛋白、胰凝乳蛋白酶等），他们在变性剂和强还原剂的作用下，解离成亚基或单条肽链。因此，对于这一类的蛋白质，SDS—PAGE测定的只是它们的亚基或单条肽链的分子量，而不是完整蛋白质的分子量。为此，对这类样品分子量的测定，还必须采用其他测定方法作参照。当然这也使得SDS—PAGE特别适用于寡聚蛋白及其亚基的分析鉴定和分子量的测定。另外，还有一些电荷异常和构象特殊的蛋白质（如组蛋白F1），含有较大辅基的糖蛋白和含有二硫键较多的蛋白质，以及一些结构蛋白（如胶原蛋白）等，它们在SDS—凝胶系统中，电泳的迁移率与分子量的对数不呈线性关系。因此，为了测得真实和完整的蛋白质分子量，通常可采用多种方法进行测定和相互验证。三、器材1.夹心式垂直板电泳槽（附带凝胶模135×100×1.5mm，1台/组），生化理论与实践实验指导62.直流稳压电源（电压300—600V，电流50—100mA），3细长头的滴管1只/组4.1ml注射器，5.微量注射器（10或50μL），四、试剂1.蛋白Marker20次/支：按使用说明配制2.BSA（牛血清白蛋白）3.连续体系SDS—PAGE有关试剂1）0.2mol/LpH7.2磷酸盐缓冲液：称Na2HPO4·12H2O51.58g及NaH2PO4·2H2O8.74g，溶于重蒸水中并定容1L。2)5×样品溶解液（上样液）组分浓度：250mmol/LTris•Cl(pH6.8)10%(W/V)SDS（电泳级）0.5%(W/V)溴酚蓝（BPB）50%(V/V)甘油5%(W/V)β-巯基乙醇（2-ME）配制量5ml配制方法：a．称量下列试剂置于10ml塑料离心管中。1MTris•Cl(pH6.8)1.25mlSDS（电泳级）0.5g溴酚蓝（BPB）25mg甘油2.5mlb．加去离子水溶解后定容至5ml。c．小份（500ul/份）分装后于室温保存。d．使用前将25ul的2-ME加到每小份中。e．加入2-ME的样品溶解液可在室温下保存一个月左右。3)凝胶贮液生化理论与实践实验指导7称Acr30g，Bis0.8g，加重蒸水至100ml，过滤后置棕色瓶内，4℃贮存可用1—2个月。4)凝胶缓冲液称SDS0.2g，加0.2mol/LpH7.2磷酸盐缓冲液至100ml。4℃贮存，用前稍加温使SDS溶解。5)1%TEMED取TEMED1ml，加重蒸水至100ml，置棕色瓶内4℃贮存。6)10%过硫酸铵（AP）称AP10g，加重蒸水100ml，置棕色瓶内4℃贮存。7)电极缓冲液（0.1%SDS，0.1mol/LpH7.2磷酸盐缓冲液）：称SDS1克，加500ml0.2mol/LpH7.2磷酸盐缓冲液，再用蒸馏水定容至1L。8)2%琼脂（糖）粉称琼脂（糖）2g，加100ml上述电极缓冲液，4℃贮存。4.固定液取50%甲醇454ml，冰乙酸46ml混匀。5.染色液考马斯亮蓝R2500.125g，加上述固定液250ml，过滤后应用。6.脱色液冰乙酸75ml，甲醇50ml，加蒸馏水定容至1L。五、操作（一）安装夹心式垂直板电泳槽夹心式垂直板电泳槽操作简单，不易渗漏。这种电泳槽两侧为有机玻璃制成的电极槽，两个电极槽中间夹有一个凝胶模，该模由1个凵形硅胶框、长与短玻璃板及样品槽模板（梳子）所组成。电泳槽由上贮槽（白金电极在上或面对短玻璃板），下贮槽（白金电极在下或面对长玻璃板）和回纹冷凝管组成。两个电极槽与凝胶模间靠贮液槽螺丝固定。各部分按下列顺序组装：1）装上贮槽和固定螺丝销钉，仰放在桌面上。2）将长、短玻璃板分别插到凵形硅胶框的凹形槽中。注意勿用手接触灌胶面的玻璃。3）将已插好玻璃板的凝胶模平放在上贮槽上，短玻璃板应面对上贮槽。生化理论与实践实验指导84）将下贮槽的销孔对准已装好螺丝销钉的上贮槽，双手以对角线的方式旋紧螺丝帽。5）竖直电泳槽，用细长头滴管吸取已熔化的2%琼脂（糖）加在长玻璃板下端与硅胶框交界的缝隙内，其目的是封住空隙，加琼脂（糖）溶液时中