基因编辑方法CRISPR-Cas9

CRISPR-Cas9一种新型基因编辑方法又称基因组定点修饰技术，通过在某些物种基因组中进行靶向特异性的突变，从而解答并提出更多精确的生物学问题。方法包括：•锌指核酸酶（Zinc-fingernuclease，ZFN）技术•转录激活因子样效应物核酸酶（Transcriptionactivator-likeeffectornuclease，TALEN）技术•Cas9/gRNA系统(CRISPR-cas9技术)基因组编辑技术Cell2014157,1262-1278Figure2B不论是TALEN技术还是ZFN技术，其定向打靶都依赖于DNA序列特异性结合蛋白模块的合成,将蛋白模块与限制性内切酶(FokⅠ)的DNA切割域融合而得到。由蛋白特异结合域定位，DNA切割域剪切。锌指核酸酶（ZFN）＆转录激活因子样效应物核酸酶（TALEN）技术Cell2014157,1262-1278Figure2ACRISPR-Cas9技术•原理：规律性重复短回文序列簇（clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats，CRISPRs）•CRISPR-Cas系统是细菌和古细菌在不断进化的过程中获得一种适应性免疫防御机制，研究者根据CRISPR-Cas系统的特性对此系统进行改造产生了第3代人工核酸内切酶技术——CRISPR-Cas9技术。该技术通过小片段的RNA介导对入侵的核酸进行靶向定位并通过Cas酶对核酸进行酶切、降解。•CRISPR-Cas9技术是一种多物种适应性的，位点特异性的有效基因组编码工具。Cell2014157,1262-1278Figure4CRISPR-Cas9技术从已知的序列中通过PAM进行定位寻找合适的靶位点并合成gRNA构建gRNA与/Cas9重组质粒。对重组质粒进行活性检测，敲除活性的计算挑选活性较高的敲除质粒导入培养的细胞或者生物体内进行基因组定点编辑操作利用测序、RFLP等方法检测基因组定点修饰结果sgRNA的设计•选择PAM（NGG）5‘端的一段碱基序列20nt作为原间隔序列，即敲除的靶位点。(PAM，Protospaceradjacentmotifs原间隔序列临近基序。一般形式为NGG，其作用是将间隔序列定位于入侵的噬菌体或质粒的DNA序列中)原则：•选择的序列必须在全基因组中进行比对，原间隔序列必须唯一，否则会对其他基因进行敲除而出现错误的实验结果。•优先选择DSB位点的侧翼存在重复序列（如果DSB的侧翼存在重复序列，在进行非同源末端重组时能够精确的介导断裂位点碱基的缺失）。•PAM的5‘端尽量存在酶切位点。（有利于后期的活性检测）构建重组质粒构建方案：1.一是将gRNA与Cas9连入同一个质粒载体中并以双启动子启动，载体中携带荧光报告基因（用于流式细胞仪筛选）或抗性基因（用于药物筛选）。2.二是将gRNA与Cas9分别连载不同的载体上，两个载体携带有不同的荧光报告基因或抗性基因载体选择：慢病毒载体以HIV-1的主要功能元件为基础构建起来的转基因和基因治疗载体。区别于腺病毒载体，可实现外源基因在目标细胞内稳定的传代表达。gRNA的活性检测•限制性内切酶法当Cas9/sgRNA靶点位置中间序列存在限制性内切酶切位点时，如果通过Cas9/sgRNA发生突变，这个位点将可能被破坏，而不能被内切酶酶切。可采用电泳的方法估计突变效率，以突变效率的高低来衡量sgRNA的活性。•非配对内切酶法T7核酸内切酶I（T7endonucleaseI，T7E1）能够识别不完全配对DNA并对其进行切割，如果通过Cas9/sgRNA发生突变，将基因组DNA做PCR，将相对应的PCR产物与野生型DNA的PCR产物等量混合，并退火杂交，将产生非配对DNA片段，将能被非配对内切酶T7E1剪切。用电泳的方法估计突变效率，以突变效率的高低来衡量sgRNA的活性。•SSA活性检测一个终止子插入luciferase（GFP）的编码区中央，luciferase（GFP）就会失去活性。为检测Cas9/sgRNA剪切活性，将一个Cas9/sgRNA的靶点位置序列插在终止子后。在Cas9/sgRNA的作用下，靶点位置产生DSB，细胞通过同源重组方式修复DNA，形成一个有活性的luciferase。通过与对照组的比值变化就可反应Cas9/sgRNA剪切的活性水平。降低sgRNA/Cas9脱靶率的方法Cas9的两个内切酶活性域为RuvC和HNH,两个亚基分别负责对一条DNA单链的切割。任一亚基的失活都将形成DNA单链断裂（nickedDNA）。当结合于两条互补的DNA链上相邻位置的一对sgRNA同时引导Cas9D10A识别并切割靶位点时才能造成DSB，从而加大了识别的长度，有效的提高了Cas9-sgRNA技术的特异性。Cell2014157,1262-1278Figure6A,B重组质粒导入细胞/生物体C、将编码Cas9和sgRNA的表达质粒直接转染至细胞系中。D、将纯化的Cas9和体外表达的sgRNA显微注射至受精卵，快速得到转基因动物模型。E、将编码CRISPR组分的高效价的病毒载体转导至组织或细胞，完成特定时间，组织的基因编辑。Cell2014157,1262-1278Figure6C,D,ECRISPR-Cas9技术的应用进展1.CRISPR/Cas系统可以作为一种位点特异性基因编辑平台Cas9-sgRNA在靶位点切割产生DSB后，细胞可以通过两种方式对DNA进行修复，非同源末端连接（non-homologousendjoining，NHEJ）修复方式和同源重组方式（homology-directedrepair，HDR）。NHEJ往往使得核酸链被剪切的区域发生基因突变，导致编码的基因Knockdown。而HDR往往通过供体DNA与基因组DNA之间的同源重组造成靶位点的纠正或者靶向插入外源基因Knockin。Cell2014157,1262-1278Figure2ACRISPR-Cas9技术的应用进展2.利用Cas9系统在转录水平对基因表达的调节通过点突变使Cas9蛋白的两个核酸内切酶结构域活性全部丧失获得dCas9，将dCas9-sgRNA作为与DNA特异性识别的平台，令转录因子或表观调控酶与dCas9-sgRNA融合表达，即可实现转录水平对基因表达的调节。Cell2014157,1262-1278Figure6GCRISPR-Cas9技术的应用进展3.利用Cas9系统对目标RNA序列进行操纵CRISPR/Cas蛋白亚型（Ⅲ型）被证明可以靶向消化RNA底物。预示着该技术的发展将会代替shRNA/siRNA等传统RNAi技术成为一种新型的RNA干扰物而对不同种类的细胞及动物模型中特定的基因的下游产物进行RNA干扰。Cell2014157,1262-1278Figure4截图CRISPR-Cas9技术的应用进展4.利用Cas9系统对基因组功能进行筛查Cell2014157,1262-1278Figure6FCRISPR-Cas9技术的应用进展5.Cas9系统作为DNA特定位点标签Cell2014157,1262-1278Figure6HCas9和GFP融合表达，可动态记录胞内DNA特定位点的染色体结构状态。CRISPR-Cas9技术的应用进展6.利用Cas9系统可实现对基因的诱导调控Cell2014157,1262-1278Figure6I通过化学或可控因素诱导Cas9肽片段的重建，实现对基因的诱导调控。展望到目前为止对CRISPR/Cas9技术的开发尚属初步。虽然Cas9系统会被sgRNA引导从而识别出靶序列，但脱靶效应依然存在，特异性仍待提高。与成熟的ZFN和TALEN等遗传物质靶向编辑系统相比，CRISPR/Cas9核酸内切酶系统具有构建简单方便快捷、安全性高、毒性小等得天独厚的优越性，势必将在临床治疗、基础理论研究和农牧渔业等领域发挥巨大的作用，并且将会对分子生物学研究和基因治疗领域产生深远的影响。参考文献[1]PatrickD.Hsu,EricS.Lander,andFengZhang.DevelopmentandApplicationsofCRISPR-Cas9forGenomeEngineering.Cell.2014(157):1262-1278.[2]左其生等.CRISPR-Cas介导的基因编辑工具.生物技术通报.2014(7):37-43.[3]贾良杰.CRISPR/Cas基因组靶向编辑技术综述.中国医药学报.2014,11(22):154-164.[4]齐波等.CRISPR干扰:一种由假说到现实的基因沉默技术.遵义医学院学报.2014,37(3):348-352.[5]张曼,孙秀萍,宋铭晶.慢病毒载体用于转基因技术的研究进展.中华临床医师杂志.2014,8(10):1949-1953.Thanks