科创ok

指导老师：吴云锋科创组员：姚未远张益民孟森主要内容项目背景与意义研究方法试验结果讨论一、研究背景和意义植原体是一类重要的农业有害微生物。1967年日本的土居养二（DoiY.）首先在桑树萎缩病组织韧皮部发现这类微生物。全世界报道的植原体病害超过600余种，我国有100余种，由于寄主范围广，对农林、果树、蔬菜作物危害巨大，每年损失严重多达数十亿元。一、研究背景和意义小麦蓝矮植原体典型症状是在感染病害的初期，植株会发生明显的矮缩和畸形，节间短缩成套叠状，叶片轮生，小麦基部的叶片会明显的增宽变厚并变为暗绿色，发病后期心叶发生卷曲变黄然后坏死，黄色没有规则的宽条带形成的叶片条斑就会出现在成株上部叶片上。一般情况下，发病的植株是不能够进行正常的拔节成穗的，并可能会出现抽穗呈塔状退化。2020/2/11一、研究背景和意义2020/2/11小麦感染蓝矮植原体后发病症状一、研究背景和意义WBD是一种由介体条沙叶蝉（PsammotettixstriatusL.）专化性传播的病害，现在已经成为西北地区继黄矮病之后的又一种重要病害，对小麦的稳产高产造成了严重威胁。2020/2/11一、研究背景和意义由于植原体目前还不能在培养基上培养生长，只能通过叶蝉菟丝子等介体传播在活体寄主植物上繁殖，给植原体的富集纯化带来很大难度。小麦蓝矮植原体的繁殖与染色体的纯化分离是进行基因组测序的前提。能使人们更深入地了解植原体所具有的独特基因组与丰富的生物学、生物化学、遗传学特征。本项目通过分离纯化WBD植原体染色体等工作，将为利用靶标基因防治植原体病害奠定良好基础。通过生物技术途径为我国小麦蓝矮病及其他农林园艺作物等100余种植原体病害提供有效的防治途径。一、研究背景和意义基于基因组学的遗传学、生理学和病原生物学的研究历来成为一种国家荣誉，占领这个制高点，对采用基因疗法起着决定作用。目前，我国在这方面的研究起步较晚，尚未完成一种植原体基因组分析，对植原体与寄主互作的相关基因、植原体的侵染、致病基因、细胞间的短距离与长距离运输、生理与代谢、遗传与发育等方面的研究仍为空白。到目前为止，国内外对小麦蓝矮植原体目前仅仅是对单个基因的分离，其方法相对费时，而且对基因间的互作关系不清楚，致使难以针对关键靶标基因实施防治技术。全基因组序列图谱、生理与代谢、遗传与发育、以及植原体与寄主互作、侵染与致病机制等科学问题缺乏系统研究。（1）WBD-IMP的原核表达与抗血清制备2020/2/11构建载体，进行原核表达；得到目标蛋白后进行家兔注射，常规方法制备抗血清。琼脂双扩散法进行效价测定二、研究方法ImpBImp基因不同片段的引物设计ImpCImpNImpS××××原核表达载体构建结果A：基因PCR扩增结果；B-E：pMAL-ImpB，pMAL-ImpN，pMAL-ImpC及Pmal-ImpS重组质粒的双酶切验证。原核表达产物（ImpS）的SDS-PAGE结果M：蛋白MarkerⅠ；1-4：诱导后重组质粒E.coliBL21(DE3)pLysS菌体总蛋白；5：诱导前重组质粒E.coliBL21(DE3)pLysS菌体总蛋白；6：诱导后空质粒E.coliBL21(DE3)pLysS菌体总蛋白；7：诱导前空质粒E.coliBL21(DE3)pLysS的菌体总蛋白。1234567M目标蛋白→多克隆抗体效价测定结果琼脂双扩散示意图（1:512）1：512时，有明显的抗原沉淀线，沉淀效果较好二、研究方法2020/2/11（2）田间采样与植原体检测2010年4月韩城市采样，用菟丝子扩繁保存至长春花与生菜。2020/2/11ABCD韩城市采样2020/2/11用引物对R16F2n/R16R2扩增健康小麦，发病小麦以及阳性对照16SrRNA基因的PCR结果M:MarkⅢ；0：健康小麦；1-8：发病小麦；9：泡桐丛枝；10：枣疯（3）毒源保存与扩繁2020/2/11菟丝子进行的传毒用长春花进行的毒源保存二、研究方法（4）植原体富集2020/2/11a)伤流液收集：取发病叶片（叶脉组织），严格表面擦洗消毒3次，用刀片切开嫩茎，待汁液流出，快速吸取伤流液，连续收集，，置于冰上保存，保存在冰箱中。给植原体伤流液中加入抗血清进行沉淀实验。二、研究方法取11支指形管，分别标记为B0、B10、B20、J0、J10、J20、P0、P5、P10、P15、P20，按下表加入各种溶液。2020/2/112020/2/11缓冲液对照健康对照伤流液编号B0B10B20J0J10J20P0P5P10P15P20伤流液（ml）0000.5（健康）0.5（健康）0.5（健康）0.50.50.50.50.5缓冲液（ml）4443.53.53.53.53.53.53.53.50.9%NaCl（μL）201002010020151050抗血清（μL）010200102005101520二、研究方法抗血清沉淀试验：免疫沉淀反应12h，PCR反应，分别以400g、1500g、13300g离心取沉淀，加入50微升的TS缓冲液，煮沸10分钟。4℃保存，随后进行16sPCR2020/2/11二、研究方法b）直接离心：取200毫升伤流液，分装于4个离心管中，1500g离心10分钟，取上清，18000g离心25分钟，除去上清液，将沉淀重悬于50微升的TS缓冲液中。吸取20微升的重悬液直接跑胶2020/2/11三、试验结果2020/2/11400g1500g13000g三、试验结果400g离心条件下，未检测到植原体DNA；1500g、13000g离心条件下检测到了植原体DNA2020/2/11三、试验结果2020/2/11重悬液直接跑胶结果→三、试验结果结果显示有一模糊条带，可能为植原体条带。2020/2/11四、讨论加入抗血清后，在低速离心条件下，未检测出植原体DNA，相关试验条件仍需进一步探索。煮沸过程可能导致抗血清与植原体DNA结合更加紧密，不易分离。0.5ml伤流液中植原体含量仍然较低，导致条带模糊。直接离心得到的条带若为植原体条带，则下一步工作可将其回收，进行脉冲电泳分离，即可得到高纯度的植原体DNA。谢谢敬请批评指正2020/2/11