基因工程的载体

基因工程的载体刘文利载体•定义：要把一个有用的基因通过基因工程手段送进生物细胞中，需要运载工具。携带外源基因进入受体细胞的这种工具就叫载体（Vector）。•特点：在宿主细胞中独立自主的复制、容易分离纯化、包含外源基因插入位点（不影响扩增的非必须区域）技术路线载体的分类•按来源分类：1.质粒2.噬菌体载体3.科斯载体4.真核病毒载体5.其他载体•按用途分类：克隆载体表达载体原核表达载体主要元件：强启动子SD顺序筛选标志其它调控基因真核表达载体主要元件：启动子增强子RNA剪接信号负调控元件终止子和PolyA序列质粒•在细菌细胞内作为与宿主染色体有别的复制子而进行复制并且在细胞分裂时能恒定的传递给子代细胞的独立遗传因子。•双链闭合环状DNA分子、大小在1-200kb之间。天然质粒的类型•严紧型质粒（Stringentplasmid）：多具自身传递能力的大质粒、复制与染色体DNA偶联、1-2个拷贝。•松弛型质粒（Relaxedplasmid）：分子量小、不具传递能力、复制在松弛控制下进行。•自身传递质粒和非自身传递质粒。基因工程质粒载体•1.较小的分子量和松弛型复制子•2.1-2个筛选标记•3.限制酶单一识别与切割位点•4.具有插入失活（或插入表达）的筛选基因质粒的工作原理质粒的应用•优点：具有遗传传递和遗传交换的能力，外源基因引入细菌细胞纯化和扩增外来基因或表达外来基因产物的媒介物。•应用：扩增克隆目的基因、表达外源基因产物、构建新质粒、分子杂交。pBR322pUC18/pUC19Ti质粒•宿主广泛，能够转化所有双子叶植物。•整合到宿主DNA上的T-DNA成为染色体正常遗传成分，永久居留和世代遗传。•T-DNA上的Opine合成酶基因有强大的启动子，启动外源基因高效率表达。穿梭载体•穿梭载体(shuttlevector)是指含有两个亲缘关系不同的复制子，能在两种不同的生物中复制的。例如既能在原核生物中复制,又能在真核生物中复制的载体.这类载体不仅具有细菌质粒的复制原点及选择标记基因,还有真核生物的自主复制序列(ARS)以及选择标记性状,具有多克隆位点.通常穿梭载体在细菌中用于克隆,扩增克隆的基因,在酵母菌中用于基因表达分析.BAC•细菌人工染色体（BAC）是指一种以F质粒为基础建构而成的细菌染色体克隆载体，长用来克隆150kb左右大小的DNA片段，最多可保存300kb个碱基对。YAC•酵母人工染色体（YAC）载体是利用酿酒酵母的染色体的复制元件构建的载体，其工作环境也是在酿酒酵母中。酿酒酵母含16条染色体，其大小为225-1900kb，总计有14×106bp；具真核mRNA的加工活性。λ噬菌体•λ噬菌体时一种大肠杆菌双链DNA噬菌体，含61个基因，其中38个参与生命周期的活动，重组的DNA可随寄主细胞一起复制和增值。•研究历史悠久，遗传背景和生物学特性明确。•寄主狭窄，安全性高。•线性双链DNA两端具有12个核苷酸组成的粘性末端（环化后形成cos位点）。λDNA分类•插入型载体：10kb以内的外源基因插入，用于cDNA及小片段DNA的克隆。免疫缺陷型和β-半乳糖苷酶失活型•替换型载体：承受较大分子量的外源DNA片段，适用于高等真核生物的染色体DNA克隆。•与质粒相比，具有易操作、阳性克隆多等特点，广泛用于各类基因库的构建。•已克隆和表达的有DNA聚合酶和DNA连接酶Ⅰ等。•温度敏感突变控制溶源诱导。柯斯质粒•是一类由人工构建的含有λDNA的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。特点•具有λ噬菌体的特性•具有质粒载体的持性•具有高容量的克隆能力•具有与同源序列的质粒进行重组的能力柯斯克隆原理•正常情况下的λDNA形成数百个拷贝组成的多连体分子。•cos位点与Ter体系是柯斯克隆的两大必要条件。柯斯质粒的优点•具备噬菌体和质粒两方面的特性，提高了克隆DNA片段能力（31kb-45kb），多用于构建真核生物的基因文库。•非重组体出现的概率较低，提高了筛选外源基因重组体的几率。M13噬菌体•丝状大肠杆菌噬菌体•单链环状DNA分子，长约6.4kb•生活史：含F质粒雄性大肠杆菌特有，通过性毛转染(+)链DNA，合成200个(-)链DNA模版，再继续合成(+)链DNA。•克隆载体单链噬菌体载体的优点•M13的感染与释放不会杀死宿主菌，仅导致宿主菌生长缓慢；•M13DNA在宿主菌内既可以是单链也可以是双链；•M13的包装不受DNA大小的限制，其噬菌体颗粒的大小可随DNA的大小而改变，即使DNA的大小比本身DNA的大小超出6倍，仍能进行包装。由于M13的这些特性，而使之广泛地用于DNA重组。猿猴空泡病毒SV40•小型20面体的蛋白质颗粒，由三种蛋白VP1、VP2、VP3构成。•闭合环状双链DNA，5.2kb，编码T抗原、t抗原、VP1、VP2、VP3。•T抗原启动DNA复制。SV40作为克隆载体有其局限性：①SV40基因组的晚期功能区的裂解性，不利于外源DNA的重组和表达；②早期功能区与病毒的致癌性有关，使用时有顾虑；③重组DNA片段的大小受体限制。多用于瞬时表达研究逆转录病毒核衣壳核酸：两条ssRNA与核衣壳蛋白结合形成双体结构衣壳：双层壳膜内层为衣壳蛋白，外层为内膜蛋白包膜刺突•病毒基因组全长约9200bp，其5’端和3’端各有一段相同的核苷酸序列，是长末端重复序列(LTR)，中间含有env、pol、gag3个结构基因和tat、rev、nef、vif、vpu、vpr等6个调节基因。基因组特点•结构基因env基因：编码gp41：介导病毒包膜与宿主胞膜的融合；gp120：有病毒颗粒与NT抗体及宿主细胞表面的CD4分子结合的部位。pol基因：编码产生逆转录酶(p66/p53)和整合酶(p31)，与病毒的复制有关。gag基因：编码产生蛋白前体，经酶解后形成3种蛋白(P17、P24、P15)。•调节基因：tat、rev、nef、vif、vpu、vprtat、rev和nef的产物对HIV表达的正、负调节以及对维持HIV在细胞中复制平衡和控制HIV潜伏有重要意义。•长末端重复序列(LTR)：对病毒转录的调控起关键作用。反转录病毒载体•(1)辅助病毒互补的反转录病毒质粒载体•(2)不需要辅助病毒互补的反转录病毒质粒载体•(3)广寄主的反转录病毒载体•(4)反转录病毒表达载体逆转录病毒表达载体•反转录病毒的基因组能够承载数个外源基因，最大的插入片段可达6kb左右，这样重组的反转录病毒仍能正常地增殖。而如果在包装之前能通过剪辑作用使基因组长度缩短，那么插入的外源DNA则可增加到20kb。由此可见，反转录病毒基因组具有相当大的克隆能力。现在已经发展出许多种反转录病毒的表达载体。逆转录病毒载体特点•逆转录病毒肿瘤基因可以在大多数的细胞中转录。•寄主广泛，包括脊椎动物和无脊椎动物。•反转录病毒具有强启动子，克隆此类载体上的外源基因有可能得到有效的表达。•感染效率高，不会导致寄主死亡，可遗传。慢病毒载体•慢病毒慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。