第12章-抗生素类药物

第十二章抗生素类药物的分析Antibiotics抗生素类药物的质量分析鉴别：真伪检查：含量（效价）测定：质量的优劣第一节概述官能团的显色反应光谱法：IR,UV色谱法生物学法（一）鉴别试验1．控制有机和无机杂质的指标2．影响产品稳定性的指标3.与临床安全性密切相关的指标异常毒性、热原、细菌内毒素等4．其他：悬浮时间与抽针试验等（二）检查抗生素的活性表示每毫升或每毫克抗生素供试品中含有某种抗生素有效成分的多少。以效价单位U表示测定方法微生物检定法理化方法（三）含量或效价测定微生物检定法•以抗生素对微生物的抑制或杀伤能力来衡量其效价•分子结构复杂、含多个组分的抗生素：首选方法理化方法•根据分子结构，利用物理化学性质进行主要采用HPLC•适用于：高纯度、化学结构已确定的抗生素•缺点：不一定代表生物效价；易受杂质干扰按化学结构分：•β–内酰胺类•氨基糖苷类•四环素类•大环内酯类、苯烃胺类•多肽类、蒽环类、多烯大环类•其他抗生素的分类一．化学结构与性质（一）化学结构青霉素族：侧链+6-氨基青霉烷酸母核头孢菌素族：侧链+7-氨基头孢菌烷酸母核第二节β-内酰胺类抗生素ONRCOHNSCOOHCH3CH3AB侧链A：β-内酰胺环B：氢化噻唑环青霉素(penicillins)ONRCOHNSCOOHAB侧链A：β-内酰胺环CH2R1B：氢化噻嗪环头孢菌素(cephalosporins)123456712345678αβαβ*****酰胺侧链青、头的共性结构游离羧基β–内酰胺环青霉素族代表药物：•青霉素钾（钠）benzylpenicillinpotassium(sodium)即苄青霉素钾（钠）•羟氨苄青霉素（钠）即阿莫西林（钠）amoxicillin•氨苄青霉素（钠）即氨苄西林（钠）ampicillinCH2CHHONH2CHNH2头孢菌素族代表药物：头孢氨苄：氨苄头孢菌素cefalexin头孢羟氨苄：羟氨苄头孢菌素cefadroxil溶解性旋光性酸性β–内酰胺环的不稳定性UV特性（二）性质酸性羧基→酸性•与碱金属(Na+、K+)成盐：易溶于水•与有机碱(普鲁卡因)成盐：难溶于水，易溶于甲醇等有机溶剂不稳定性因素四元环张力大酰胺键易水解稳定性与含水量和纯度的关系干燥、纯净→稳定水溶液、不纯净→不稳定青霉素水溶液：pH6-6.8时较稳定β–内酰胺环的不稳定性共轭体系→UV•青霉素类：母核无明显UV，侧链多数含苯环取代基•头孢菌素类：母核：共轭体系O=C—N—C=CO=C—C=C侧链：多数含苯环取代基UV特性二．鉴别试验•光谱法：IR、UV•色谱法•呈色反应•各种盐的反应（一）呈色反应羟肟酸铁反应NSOROCHNCH2R1COOHCHNSROCHNCH2R1COONaONHOHCHNSROCHNCH2R1COOHONHOFe/3H2NOH●HClNaOH,C2H5OHFeNH4(SO4)2H+ONSCOOHCH3CH3CH2NH2COHN茚三酮蓝紫色类似肽键的反应茚三酮反应：双缩脲反应：β-内酰胺类碱性酒石酸酮开环分解蓝紫色重氮化-偶合反应普鲁卡因青霉素水溶液酸化→青霉素+普鲁卡因钾、钠离子的火焰反应（二）各种盐的反应→重氮化-偶合反应（一）聚合物：凝胶过滤色谱法（二）有关物质和异构体HPLC：不加校正因子的主成分自身对照法三．特殊杂质检查•适用于原料、各种制剂及生物样品•常采用RP-HPLC•外标一点法定量p421四．含量测定HPLC糖+苷元缩合苷氨基糖苷缩合氨基糖+苷元(碱性环己多元醇)第三节氨基糖苷类抗生素Aminoglycosidesantibiotics结构NHHOHNOHOHCNH★H2NOCNHNH2OCH3CHOOHOOHNCH3OHOHCH2OH★★1234561'2''3'4'5''1''2'3''4''6''链霉胍链霉糖N-甲基-L-葡萄糖胺链霉双糖胺苷元糖结合较牢结合较弱一．结构与性质链霉素庆大霉素（庆大霉素C复合物）OCR1HNR3R2123461'2'3'4'5'6'1''2''3''4''5''NH2OHOH2NNH2OOOHNHCH3OHCH35★★★★★绛红糖胺脱氧链霉胺加洛糖胺糖苷元糖1.溶解性：水溶性2.旋光性：手性C3.碱性：多与硫酸成盐碱性中心：链霉素3个，庆大霉素5个4.UV：链霉素：230nm处有紫外吸收庆大霉素：无UV吸收性质5．稳定性硫酸链霉素：•水溶液在pH5-7.5条件下，稳定•过酸或过碱易水解失效硫酸庆大霉素：•对光，热，空气均较稳定•水溶液在pH2-12条件下也稳定(一)麦芽酚(maltol)反应链霉素特征反应二．鉴别试验HOHNOHOHNHOCNHH2NCHNNH2OCH3OHCHOOOHNCH3OHOHCH2OHOOOHCH3OOOCH3Fe/3H2ONaOHH+Fe3+麦芽酚紫红色（二）坂口（Sakaguchi）反应链霉素水解产物链霉胍的特征反应链霉素NaOH水解链霉胍8-羟基喹啉orα-萘酚NaBrONaBrO产物1产物2橙红色产物OHOHN8-羟基喹啉α-萘酚（三）光谱法IRUV：240-330nm庆大霉素无紫外吸收峰链霉素B（甘露糖链霉素）1.来源：反应中间体2.方法：TLC中的杂质对照品法杂质对照品：甘露糖菌种发酵链酶素B甘露糖链酶素B苷酶甘露糖链酶素+三．有关物质及组分分析（一）有关物质效价、毒副作用不同Chp:规定控制各组分的相对百分含量发酵菌种不同工艺差别C组分比例不一致（二）庆大霉素C组分测定1.测定方法：HPLC-衍生UV法(USP)衍生电化学检测（BP)蒸发光散射检测（Ch.P)2.衍生法原理：3.衍生方式：柱前衍生庆大霉素（氨基）+邻苯二醛+巯基醋酸pH10.4异吲哚衍生物λmax=330nmNRSCH2COOH4.分离模式：RP-离子对HPLCSP：ODSMP：水-冰醋酸-甲醇-庚烷磺酸钠5.定量方法：峰面积归一化Rf:某组分的峰面积；Rs:所有组分峰面积之和%100%sfRR含量6.讨论：•流动相：极性过强，出峰慢极性过弱，出峰快•离子对试剂：克服C组分的异吲哚衍生物在ODS柱上的吸附，增加保留；衍生化试剂不形成离子对，保留值变化不大微生物检定法：各国药典采用，测定效价HPLC：衍生化UV或电化学或蒸发光散射检测离子对色谱法：烷基磺酸盐为反离子离子交换色谱法：酸性条件下在阳离子交换柱上分离反相色谱法四．含量测定例：HPLC-蒸发光散射法测定硫酸依替米星含量SP：ODSMP：三氟醋酸溶液-甲醇分离模式：RP-离子对色谱检测器：蒸发光散射蒸发光散射检测器工作原理•检测三步曲•流动相要求：必须是挥发性的，不能含有缓冲盐•样品要求：雾化蒸发检测挥发性低于流动相检测三步曲示意图色谱流出物与通入的气体混合雾化蒸发除去流动相样品组分形成气溶胶强光照射气溶胶，产生散射光，检测一．化学结构与性质（一）结构四并苯或萘并萘的衍生物OHOHOHOOOHHCONH2N(CH3)2HOHCH3H四环素*****手性C14655a11ABCD第四节四环素类抗生素OHOHOHOOOHHCONH2N(CH3)2ClOHCH3H金霉素OHOHOHOOOHHCONH2N(CH3)2HOHCH3OH土霉素氢键RR1R3R2多西环素：R3-羟基美他环素：R3-羟基1．两性与溶解度弱酸性弱碱性与酸、碱均能成盐：多用盐酸盐其盐：溶于水、酸或碱性溶液，不溶于有机溶剂游离四环素类：pH4.5-7.2内难溶于水酚羟基、2个烯醇型羟基二甲胺基（二）性质2．紫外和荧光性质UV照射下，四环素类及其降解产物有荧光3．不稳定性干燥避光：游离形式和盐类都较稳定水溶液：对酸、碱、各种氧化剂（包括空气中的氧）都不稳定差向异构化降解性质（1）差向异构化四环素金霉素4-差向四环素4-差向金霉素pH2～6蓝色荧光淡黄黑可逆反应PO43-、枸橼酸根、Ac-等阴离子：可加速差向异构化土霉素：不易差向异构化(氢键形成→较稳定)OOHCONH2(CH3)2NOHHOOHCONH2N(CH3)2HOHAApH2.0~6.0（2）降解性酸性下降解：6位上-OH与5a位上的H发生消去反应四环素金霉素脱水四环素脱水金霉素pH2λmax=445nmλmax=435nmROHCH3OHOOHHRCH3OHOOHRCH3OHOHOH2ODDDCBBCBC脱水四环素类•碱性降解：ROHCH3OHR'''OOHOOHCONH2NHOHCH3CH3CH3CH3ROHR'''OOOHCONH2NHOHOCH3OOH-四环素异四环素1．浓硫酸反应可区别各种四环素类盐酸四环素盐酸金霉素盐酸土霉素盐酸多西环素盐酸美他环素浓硫酸深紫色蓝绿朱红色黄色橙红色二．鉴别试验2．三氯化铁反应酚羟基的反应3．TLCEDTA作用：克服痕量金属离子造成的拖尾4.HPLC5.UV、IR有关物质•异构体，降解物4-差向四环素（ETC）差向脱水四环素（EATC）脱水四环素（ATC）盐酸金霉素（CTC）•盐酸四环素中有关物质的检查：HPLC加校正因子的主成分自身对照法不加校正因子的主成分自身对照法p438三．特殊杂质检查四．含量测定HPLC法例：盐酸四环素的含测•RP-HPLC三乙胺p440•外标一点法本章基本要求•掌握β-内酰胺类抗生素的结构特征、理化性质•掌握β-内酰胺类抗生素的呈色鉴别反应、HPLC含量测定方法•掌握氨基糖苷类抗生素的结构特征、理化性质、鉴别方法（麦芽酚反应、坂口反应、UV）•掌握庆大霉素C组分的测定、HPLC含量测定方法•掌握四环素类抗生素的结构特征（四环素、金霉素、土霉素）和性质