第20讲第四章细胞工程制药(1)

第四章细胞工程制药细胞工程概说细胞技术在生物制药中的应用细胞工程概说细胞工程的定义与内涵动物细胞工程及特点植物细胞工程及特点细胞固定化技术与细胞反应器细胞工程的定义与内涵细胞工程（CellEngineering），也称细胞技术，是生物工程的主要内容之一。它是指应用现代细胞生物学、发育生物学、遗传学和分子生物学的理论与方法，按照人们的需要和设计，通过细胞融合、核质移植、染色体移植以及组织和细胞培养等方法，快速繁殖和培养出人们所需要的新物种的生物工程技术。按照定义，发酵技术也属于细胞工程的范畴。因为发酵过程本身就是一个大规模微生物细胞培养技术，或者说所谓（动植物）细胞培养技术正是借鉴了传统发酵技术而发展起来的。细胞工程的定义与内涵细胞操作技术细胞融合细胞核移植细胞器移植染色体添加外源染色体导入胚胎移植细胞培养组织培养细胞融合在自发或人工诱导下，两个不同基因型的细胞或原生质体融合形成一个杂种细胞。基本过程包括细胞融合形成异核体、异核体通过细胞有丝分裂进行核融合、最终形成单核的杂种细胞。有性繁殖时发生的精卵结合是正常的细胞融合，即由两个配子融合形成一个新的的二倍体。细胞核移植所谓细胞核移植技术，就是将供体细胞核移入除去核的卵母细胞中，使后者不经过精子穿透等有性过程即无性繁殖即可被激活、分裂并发育成新个体，使得核供体的基因得到完全复制。以供体核的来源不同可分为胚细胞核移植与体细胞核移植两种。1供体核的获得2受体细胞的获得及其去核3核卵重组4细胞融合/激活5重构胚的培养与移植细胞器移植细胞工程的一项技术，将一个物种的细胞器分离出来，通过与另一物种的原生质体混合培养及原生质体的包饮作用，把细胞器摄入到细胞内，进行作物的遗传改良，目前研究较多的主要是叶绿体的摄入。显微操作技术是指在高倍复式显微镜下，利用显微操作器（micromanipulator）进行细胞或早期胚胎操作的一种方法。显微操作器是用以控制显微注射针在显微镜视野内移动的机械装置。显微操作技术包括细胞核移植、显微注射、嵌合体技术、胚胎移植以及显微切割等。染色体添加染色体工程（chromosomeengineering）按设计有计划削减、添加和代换同种或异种染色体的方法和技术。也称为染色体操作。它不仅在改良植物的遗传基础培育新品种上受到重视，而且也是基因定位，和染色体转移等基础研究的有效手段。■胚胎移植胚胎移植又称受精卵移植，俗称人工授胎或借腹怀胎，是指将雌性动物的早期胚胎，或者通过体外受精及及其他方式得到的胚胎，移植到同种的、生理状态相同的其他雌性动物体内，使之继续发育为新个体的技术。胚胎分割移植是指采用机械方法将早期胚胎切割成2等份、4等份或8等份等，经移植获得同卵双胎或多胎的技术。细胞培养原代培养是指从供体内取出组织后，经机械以及消化分离成单个细胞或单一型细胞群，使之在体外模拟人体生理环境，在无菌、适当温度和一定的营养条件下，生存、生长和繁殖。传代培养原代细胞培养成功以后，需要进行分离培养，否则细胞会因生存空间不足或密度过大，营养障碍，影响细胞生长。细胞由原培养瓶内分离稀释后传到新的培养瓶中培养的过程称之为传代培养。传代细胞允许培养的细胞扩增(形成细胞株)，可以进行细胞克隆，易于保存，但可能丧失一些特殊的细胞和分化特征。组织培养在无菌的条件下，将植物的器官或组织的一部分切下来，放在适当的人工培养基上进行培养，这些组织器官就会进行细胞分裂，形成没有分化的一团薄壁细胞，叫愈伤组织。在适合的光照、温度和一定的营养物质与激素的条件下，愈伤组织开始分化，发育成一棵完整的植株。动物细胞工程及特点动物细胞结构及生理特点没有细胞壁成熟细胞难以脱分化分裂周期长：12～48h贴附生长，接触抑制寿命有限：一般在50代左右环境敏感培养条件要求高：细胞生长因子培养工艺不同于微生物或植物细胞动物细胞工程及特点动物细胞培养的基本程序动物细胞工程及特点动物细胞系1．原代细胞系直接取自动物组织、器官，经过粉碎、消化而获得的细胞。2．二倍体细胞系是原代细胞经过传代、筛选、克隆，从多种细胞成分的组织中挑选出来的具有某种特征的细胞株。3．连续细胞系是从正常细胞转化而来，分化不成熟的、获得了无限增殖能力的一种细胞。4．基因工程细胞系通过基因工程技术，把编码蛋白质的基因在分子水平上进行设计、改造、重组，所获得细胞系。冷冻保存液氮温度（－196℃），保存10年以上。－70～－80℃保存细胞，短期内对细胞的活性无明显影响，但随着冻存时间延长，细胞存活率明显降低。－40～0℃范围内保存细胞的效果不佳。动物细胞工程及特点动物细胞培养基的组成及常用培养基常用成分有：（1）氨基酸（2）维生素。最低基本培养基只含B族维生素，其它都靠从血清中获得。（3）无机盐（4）葡萄糖（5）激素和生长素。一般加血清即可满足需要，常用的有小牛血清、胎牛血清、人血清等。动物细胞工程及特点常用培养基：（1）天然培养基主要有生物性体液（如血清）、组织浸出液（如胚胎浸出液）、水解乳蛋白等。（2）合成培养基根据天然培养基的成分，用化学物质对动物体内生存环境中各种已知物质在体外人工条件下的模拟，经过反复试验筛选、强化和重新组合后形成的培养基。（3）无血清培养基无血清培养基一般是由基础培养基和替代血清的补充因子所组成。动物细胞工程及特点培养条件（1）温度昆虫细胞培养温度一般25～28℃，哺乳动物细胞的培养温度一般37℃。（2）pH动物细胞培养适宜的pH一般在7.2～7.4，低于6.8或高于7.6都不利于细胞生长，严重时会导致细胞死亡。（3）溶氧及气体环境培养初期要求较低的溶氧水平，对数生长期或培养后期，溶氧水平要求增加。除了氧气供应外，还应注意培养基的氧气和CO2的平衡。（4）渗透压大多数动物细胞对渗透压的忍耐程度较强，只要渗透压变化不很剧烈，一般对培养物不会造成致命伤害。动物细胞渗透压的维持一般采用平衡盐溶液。动物细胞工程及特点动物细胞培养技术1．灌注悬浮培养2．贴壁细胞培养3．固定化细胞培养灌注悬浮培养悬浮培养是指细胞在培养器中自由悬浮生长的培养方法，它是在微生物发酵的基础上发展起来的一种动物细胞培养技术。非贴壁依赖性细胞如血细胞、淋巴细胞、某些肿瘤细胞（包括杂交瘤细胞）以及某些转化细胞，可以采用此法进行培养。贴壁细胞培养贴壁细胞培养指必须将细胞贴附在固体介质表面上才能进行细胞培养的方式，主要用于非淋巴组织等贴壁依赖性细胞的培养。培养时，在固体载体表面上生长并扩展成一单层，所以又称为单层培养或微载体系统培养法。由于大部分动物细胞无细胞壁，属于贴壁依赖性细胞，所以贴壁培养是动物细胞培养的一种重要方法。固定化细胞培养固定化细胞培养是指将细胞限制或定位于特定空间位置的培养技术。采用载体使整个细胞固定化。常见的固定化培养是包埋培养，常用凝胶（海藻酸钙、琼脂糖、血纤维蛋白等）来包埋细胞，能使细胞处于活性状态进行培养。植物细胞工程及特点植物细胞的培养特性1、细胞个体较大（较微生物细胞大的多），有纤维细胞壁，细胞抗剪切力差；2、细胞生长速度较慢，容易被微生物污染，培养时需添加抗生素；3、细胞培养过程中易聚集成团，较难进行悬浮培养；4、培养时需供氧，但培养液黏度较大，不能耐受强力通风搅拌；5、植物细胞具有群体效应及解除抑制性；6、细胞培养产物滞留于细胞内，产量低；7、植物细胞具有结构和功能全能性。植物细胞工程及特点培养基组成（1）基本培养基基本培养基的各种成分是愈伤组织和悬浮细胞培养的物质基础，尤其在稳定期次级代谢产物累积时更是如此。（2）碳源碳源通常以光自养培养中的CO2或异养培养中的糖类两种形式提供，其性质和数量往往对培养细胞的生物量有很大的影响。CO2可以诱导某些特征反应，如在金苹果的悬浮细胞培养中，高浓度CO2可产生一种特有的苹果香味。植物细胞培养中使用最多的碳源是糖类，对次级代谢产物的影响主要取决于所使用的糖类的种类及细胞次级代谢产物的生物合成过程。植物细胞工程及特点（3）植物生长调节剂植物生长调节剂在植物细胞培养中起着非常重要的作用，可能是关键性的。但是植物材料和生理状态的差异，无一定的规律可循，必须通过仔细的实验观察才能确定其合适的数量和种类。与植物细胞培养和组织培养有关的主要激素：IAA、GA、CTK（4）诱导子生产某些植物次级代谢物质需要刺激性物质。植物抗毒素（phytoalexins）是指在植物防御系统内能对抗微生物进攻的某些次级代谢产物（根据其功能又称为“后感染防御物质”）。尽管在有些情况下代谢产物可能会连续合成，但在另外一些情况下只有细胞被刺激时才能产生植物抗毒素，或仅在被诱导时其产量才能增加。植物细胞工程及特点植物细胞培养技术培养罐类型、通气、搅拌和培养方法等。1、培养容器小规模实验室培养所用的培养容器（50~500ml）具有较高的氧转移率，通过简单的定期搅拌，培养物的每个部位均可得到比大规模培养更好的氧供应。工业化生产所有培养容器就是大型发酵罐（500L以上）。植物细胞工程及特点2、培养方法⑴单细胞培养从植物组织器官分离得到单细胞，在特定条件下可以形成具有不同性状的愈伤组织（细胞系），或者发育成完整的植株——试管苗。⑵悬浮细胞培养是指单细胞或小的细胞团块悬浮于培养液中进行生长的过程。主要用于代谢物的生产，如属于次级代谢物质，则需加中间体或诱导子等。⑶大规模细胞培养类似于微生物发酵的培养过程，其产物可以是细胞，也可以是代谢产物（初级、次级产物）。⑷固定化细胞培养与前述一样，是将细胞包埋在固体材料中，细胞保持活性。下面将详细讨论。细胞固定化技术与细胞反应器（一）固定化细胞技术利用物理或化学的手段将游离的细胞定位于限定的空间区域，并使其保持活性并可反复使用的技术称为细胞的固定化，该细胞称为固定化细胞。固定化细胞有如下几方面的优点：①它不需进行破碎细胞而直接利用胞内酶，降低了制备成本；②酶在细胞内的环境中比较稳定，酶活力的损失较少；③边加入培养基，边排出产物，能有效地避免反馈抑制和产物消耗；④适合于进行多酶顺序连续反应；⑤易于进行辅助因子的再生，因而更适合于需要辅助因子的反应。细胞固定化技术与细胞反应器细胞固定化方法1.吸附法2.共价结合法3.交联法4.包埋法1.离子结合2.共价结合3.交联4.聚合物包埋5.疏水相互结合6.脂质包埋7.微胶囊细胞固定化技术与细胞反应器细胞反应器利用细胞和酶等生物功能进行化学反应的系统，称为生物反应器，分别称为细胞反应器和酶反应器。微生物发酵装置是典型的生物反应器，从广义的概念来讲，一个摇瓶（如三角瓶）和一个摇瓶机的结合，就可称为一个生物反应器。现代生物反应器的设计思想是把从初级原料到最终产物这中间的众多工艺流程全部串联在一个生物反应单元系列里，构建成一个体积适中的新型反应器。高度自动化是生物反应器的另一重要特点。发酵过程中的一些重要参数的信号，必须通过一种媒介装置传递到反应器外部，反映到检测仪上，这种装置称为生物传感器，它起到传递信号的作用。思考题1、细胞工程的概念与研究内容。2、简要说明动、植物细胞工程异同点。3、细胞固定化技术的基本要点。4、什么是生物反应器？植物细胞全能性植物的每个细胞都包含着该物种的全部遗传信息，从而具备发育成完整植株的遗传能力。在适宜条件下，任何一个细胞都可以发育成一个新个体。植物细胞全能性是植物组织培养的理论基础。植物细胞培养基常用的培养基有几十种。如MS（下表）、B5、E1、N6培养基等。其中以MS、B5等应用较为广泛。大量元素(20×)用量(mg/L母液)微量元素(200×)用量(mg/L母液)NH4NO333000KI166KNO338000H3BO31240CaCl2•2H2O8800MnSO4•4H2O4460MgSO4•7H2O7400ZnSO4•7H2O1720KH2PO43400Na2MoO4•2H2O50FeSO4•7H2O(200×)5560CuSO4•5H2O5Na2.EDTA•7H2O7460烟酸(200×)100肌醇(200×)20000