第三章 动物细胞工程制药

生物芯片理论与实验培训资料张亮博士主编博奥生物有限公司生物芯片北京国家工程研究中心前言生物芯片技术自20世纪90年代初期被报道，在迄今约20年的时间里，它所覆盖的内涵在一直不断地扩大，技术方法也在一直不断地完善。按照用途来分，生物芯片又可以分为基因表达谱芯片、MicroRNA检测芯片、基因甲基化检测芯片、转录因子DNA吸附位点检测芯片、微生物检测芯片等等；可以预计，在生物芯片技术中，能高通量并行分析成千上万个基因表达的基因表达谱芯片技术在未来10年内将会成为分子生物学实验室中常规的实验技术。基因表达谱芯片技术普及的原因除了它的重复性、精确性、灵敏度等技术指标逐步改善，已经能与传统的方法，例如NorthernBlot、定量RT-PCR方法相媲美外，还将得益于具有自主知识产权的国产关键生物芯片仪器研制开发的成功。国内的很多生命科学研究者已经从原来的单个基因、单个蛋白的角度转入到组学研究水平，并开始在使用与组学研究特点相适应生物芯片技术。针对国内已经或者正在准备搭建生物芯片平台的分子生物学实验室，生物芯片北京国家工程研究中心（简称“NERCBBT”）凭借国家工程中心的科研地位，利用本中心整合了分子生物学、精密仪器、光学、表面化学以及软件人才的优势，本着让研究者真正把生物芯片技术用于实际研究的原则，特举办生物芯片技术理论与实验操作培训班。此培训内容，很多来自于迄今为止的公开文献资料和我们实验室积累的经验；尽管我们尽可能及时跟踪国际上生物芯片技术领域内的进展，一些概念和技术方法可能还是没有及时更新，敬请读者谅解。生物芯片理论与实验培训资料理论部分总概在什么情况下用到生物芯片技术？1、高通量；2、半定量以下研究中，哪些情况适合使用生物芯片技术？A、检测某个药物处理细胞后，观察细胞的基因表达情况；B、检测食品中是否有对人体有害的5种微生物存在；C、检测HPV病毒中的是否存在能引发子宫癌的11种高危亚型；D、检测牛奶中是否有结核杆菌存在；E、检测在造血干细胞的分化过程中miR-223是否有变化；目前生物芯片的发展趋势，是和组学平行发展起来的。生物芯片技术已经进入到了生命科学的哪些研究领域？建立一种新的生物芯片技术平台，我们往往需要先从已利用其他技术方法确认的实验模型和实验数据出发，来对生物芯片的结果进行确认。DNA芯片检测DNA上的SNP位点3检测DNA上甲基化位点8,9检测基因表达7检测microRNA表达4检测转录因子和DNA上的结合位点2检测微生物的种类5,6蛋白芯片10,11小分子化合物检测芯片112,13检测DNA片段的缺失与扩增博奥生物1生物芯片理论与实验培训资料理论部分基因表达谱芯片技术我们将以一个经典的实验模型来演示基因表达谱芯片技术是如何检测基因表达变化的。酿酒酵母的热激（Heatshock）反应是一个经典的研究基因表达变化的模型。大量的文献都报道过，酵母通过热激处理后，很多编码热激蛋白的基因表达上调，而一些编码核糖体蛋白的基因表达下调。1如何通过生物信息的方法高通量自动实现引物或者探针的设计（有实验演示如何高通量设计大批探针或者PCR引物）1.1对于原核生物，设计PCR产物的cDNA芯片比较合适原因：A、原核微生物的RNA不带PolyA的尾巴，难以和rRNA区分开，因此对mRNA进行特异性的标记比较困难，获得较好的芯片杂交信号是原核表达谱芯片技术中的主要矛盾；B、原核微生物基因组DNA上所含内含子少，易于以基因组DNA序列为模板设计PCR引物。高通量自动设计PCR引物的原则主要包括：A、引物针对靶基因具有序列的特异性；B、上游、下游引物之间不容易形成引物二聚体；C、每条引物自身不容易形成发卡结构；D、PCR产物和其他的基因同源性尽可能小。1.2对于真核生物，若基因序列已知，设计长Oligo探针的芯片比较合适原因：A、真核生物的基因组比较复杂，基因家族间的同源性较高，设计Oligo探针具有更好的特异性；B、真核生物的mRNA含有PolyA的尾巴，容易对mRNA进行特异性的标记，在Oligo芯片上获得较好的杂交信号已不是主要矛盾。高通量自动设计芯片上Oligo探针的原则主要包括：A、探针设计在60-70个碱基长度能保持杂交特异性和杂交信号强度的平衡；B、尽可能在靠近3’端1.5Kb内设计探针（原因和RNA的标记方法有关）；C、不同探针之间的Tm值相差不超过±5℃；D、探针序列和其他基因同源性小于70％；E、探针本身内部不能含有连续7个相同的碱基PolyN。2PCR产物纯化方式的选择在制备cDNA芯片时，首先需要通过PCR把靶基因扩增出来，那么对于PCR扩增产物，是否需要过柱纯化除去引物二聚体，引物二聚体残留是否会影响杂交信号？根据我们的经验，PCR产物不需要过柱纯化，直接用异丙醇或乙醇沉淀回收即可。某些时候，过柱纯化时由于洗脱液中盐的成分不确定，可能导致PCR产物难以在芯片上进行固定，异丙醇和Kit过柱纯化的一个例子参见图1。博奥生物2生物芯片理论与实验培训资料理论部分异丙醇纯化某种kit过柱纯化Kit+乙醇纯化图1.不同纯化方式对表达谱芯片PCR产物点样的影响。用异丙醇沉淀并纯化PCR产物足以满足PCR产品制备芯片的需求。当用Kit来过柱纯化PCR产物时，可能由于Kit所用的洗脱液中含有一些盐成分，可能导致DNA点样的样点形状不好。3芯片点样时样品溶解所用点样液的选择芯片点样过程中的最主要特点是点样体积非常少。点样针一次取样，往往不超过0.3μl，而需要持续点多个点，因此在点样过程中，需要防止点样针里的样品挥发而导致点样失败。最初点样的溶液是盐溶液，例如3×SSC，磷酸盐缓冲液等，点样液就容易挥发；另外用得较多的就是50％二甲基亚砜（DMSO），DMSO的分子结构如下：SOCH3CH3其中的氧原子可以和水中的氢原子之间形成氢键，使水分子不容易蒸发。但用DMSO作为点样液，DNA固定率较少，并且容易产生样点“空心点”现象。NERCBBT的化学专家根据生物芯片的点样特点，研发了晶芯®基因芯片点样液，其中含有核酸稳定剂、防水分挥发剂和粘度增稠剂等成分，能够增加核酸在芯片上的固定效率，提高DNA芯片上点杂交信号的强度和均匀性（图2），并由于它含有防水分挥发剂，能降低点制DNA芯片时的漏点率。DNA芯片点样液适用于cDNA和寡聚核苷酸芯片的点制。图2：晶芯®基因芯片点样液与50％DMSO点样液在同一芯片上的点样效果比较（杂交后）,点间距为300μm。左边：用晶芯®®基因芯片点样液点制的DNA点阵，右边：用50%DMSO点样液点制的DNA点阵。用晶芯基因芯片点样液的DNA点有以下特点：点较小、信号较强、点形状均匀规则。博奥生物3生物芯片理论与实验培训资料理论部分4DNA芯片点样环节目前制备DNA芯片主要有两种方式：A.在基片上直接合成DNA，例如Affymetrix公司利用光刻掩膜方式在硅基片表面原位合成25-mer长度的寡聚核苷酸；Agilent公司利用喷墨（ink-jet）方式在玻片表面合成60-mer长度的寡聚核苷酸；LCScience公司利用酸碱法在硅基片表面非光刻掩膜合成。B.先利用DNA合成仪上合成Oligo探针，或者制备PCR产物，然后用精密机械手把Oligo探针或者PCR产物精确点制到基片表面上。其中A类制备芯片方式需要复杂的设备和技术，难以在一般分子生物学实验室搭建起来；而B类通过点制方法制备芯片方式所需要的硬件设备和操作技能都为一般分子生物学实验室所接受，并且点制法是一个开放的平台，可以在自己兴趣基础上进行多种类型生物芯片的研发，适合实验室自行利用生物芯片技术进行研究。芯片点制过程，虽然看似一个简单的机械过程，但关系到后续芯片是否能使用。芯片点制常见问题的结果代表例子见图3。B.样点太小（80μm），重复性较差A.样点拖尾，针和基片之间不垂直C.样点粘点D.理想的点样效果，样点大小在120-150μm图3.芯片点制过程中的不同情况5不同探针所用基片的选择探针一般分为二类，A.长度在20到40-mer的寡聚核苷酸探针，例如用来检测微生物和miRNA的芯片，这种情况一般会在合成的寡聚核苷酸探针末端带上氨基修饰，可用来检测单个碱基的不同，提高检测的特异性;这种探针需要点制在醛基基片上。探针上的氨基将和基片表面的醛基发生希夫碱反应而固定DNA探针，具体的化学反应过程可参见图4。博奥生物4生物芯片理论与实验培训资料理论部分HCOHH可用于杂交的醛基修饰玻片醛基修饰的玻片醛基修饰的玻片COHCOHDNA(CH2)6NH2..亲核攻击OCHHCOHDNA(CH2)6NHCOHDNA(CH2)6NCH醛基修饰的玻片DNA(CH2)6NHHHC共价结合DNA（共价结合的中间状态）脱水反应用NaBH4还原图4.醛基基片通过希夫碱反应固定氨基修饰DNA的示意图B.没有进行氨基修饰的DNA探针，例如长度在60-70merOligo或者PCR产物，常用来检测基因表达，不需要检测到单个碱基的差异，例如当考虑到不同个体之间的核酸碱基多态性时，倒希望这样点制的表达谱芯片能兼容1-2个碱基的差异。点制这样的核酸，一般使用氨基修饰的基片。没有氨基修饰的DNA在氨基基片表面固定的化学作用包括静电吸附和共价化合键两种作用力，具体的固定原理可参见图5.博奥生物5生物芯片理论与实验培训资料理论部分DNADNANHHCH3+NHHCH3+POOSugar-POOSugar-POOSugar-NHCH3+NNCOOCHNHHCH3+NHHCH3+POOSugar-POOSugar-POOSugar-NHCH3+NNCOOCH可用于杂交的氨基修饰玻片氨基修饰的玻片DNA共价键引起的DNA吸附NHHCH3+NHHCH3+POOSugar-POOSugar-POOSugar-NNCOOCHNHHCH3+氨基修饰的玻片NHHCH3+NHHCH3+NHHCH3+NNCOOCHPOOSugar-POOSugar-POOSugar-氨基修饰的玻片DNA离子键导致的DNA吸附紫外照射或加热后（共价键的中间状态）图5.氨基修饰玻片固定DNA的原理示意图最初用来进行基因表达所用的氨基基片一般是采用多聚赖氨酸（Poly-L-lysine,PLL）覆盖的基片，很多芯片实验室按照美国Stanford大学Brown实验室提供的方法来制备PLL基片（），但Brown实验室公布的方法是物理性的涂覆，基片表面化学性质不均匀并且化学性质，包括表面亲水性、固定核酸的能力容易发生改变（参见图6）。NERCBBT的表面化学专家与分子生物学家共同研发出晶芯®三维氨基基片，选择表面平整性好，不含气泡沙眼，基片中掺杂的背景荧光物质非常低的光学级别二氧化硅裸片，经过特殊的化学清洁处理后，使二氧化硅基片表面充分暴露出羟基，然后经过化学共价键方式和基片表面暴露的羟基形成一层疏水的化学基团，然后再通过共价键的方式在第一层化学基团基础上形成氨基，最后把基片表面上非氨基的活性化学基团进行化学封闭。这样得到的三维氨基基片层次感丰富，固定核酸的能力大大增强。并且化学共价键修饰的化学表面性质比物理涂覆的要稳定很多，在我们使用过程中表现出良好的性能（参见图7）。博奥生物6生物芯片理论与实验培训资料理论部分BA图6.常规的物理涂覆的氨基基片进行DNA芯片点样容易出现的问题，A样点直径很大，导致粘点；B样点直径太小（小于80μm）,引起样点上固定的核酸分子太少，导致后续的杂交分析重复性降低。AB图7.利用NERCBBT研发的三维氨基基片进行的点样效果(A)和杂交图(B)6基因表达谱芯片上所使用的质控对照基本原理用于检测基因表达丰度的表达谱芯片，其结果可靠性可通过芯片上内参（通常是看家基因）和芯片上外标点（externalcontrols）的结果来判断，内参说明被检测样品的特征和质量，而外标则为监测实验的过程提供依据。选择基因芯片质控外标的策略常选用与研究物种没有同源性的基因或核苷酸片段，用体外转录方法制备外标基因或核苷酸片段对应的Po