第二章基因工程制药part3

一．基因工程菌的培养方式和培养设备二．基因工程药物的分离纯化工艺五、基因工程菌的培养和分离纯化技术基因工程药物的分离纯化基因工程药物或生物技术产品特点：1.目的产物在初始原料中的含量较低；2.含目的产物的初始物料组成复杂，除了目的产物外，还有大量的细胞、代谢、残留物培养基、无机盐等，特别是产物类似物对目的产物的分离纯化影响很大。3.目的产物的稳定性差，具有生物活性的物质对pH、温度、金属离子、有机溶剂、剪切力、表面张力等十分敏感，容易使其失活、变性。基因工程药物的分离纯化基因工程药物或生物技术产品特点：4.种类繁多，包括大、中、小分子、结构简单或复杂的有机化合物，以及结构复杂又性质各异的生物活性物质。5.应用面广，对其质量、纯度要求高，甚至要求无菌、无热源。基因工程药物的分离纯化一．建立分离纯化工艺的根据1.含目的产物的起始物料的特点利用基因工程菌进行发酵生产的产物，其上游过程中的各种因素均对分离纯化技术和工艺有直接影响。⑴菌体类型及其代谢特征：包括菌体的生物学性质，产物和副产物种类、产物在细菌内所处的位置，表达方式（胞内、胞外、包含体），代谢物种类、产物类似物、毒素和能降解产物的酶类等；⑵原材料和培养基的来源及其质量；基因工程药物的分离纯化一．建立分离纯化工艺的根据⑶生产工艺和条件：包括灭菌方式和条件，生产方式（连续、批式、半连续），生产周期，生产能力，工艺控制条件因素几方式等；⑷初始物料的物理，化学和生物特性：包括产物浓度、主要杂质种类和浓度、盐的种类和浓度、溶解度、pH、粘度、流体力学性质和热力学性质。基因工程药物的分离纯化2.物料中杂质种类和性质物料中杂质的含量、性质、结构、相对分子质量、电荷性质及数量、生物学特性、稳定性、溶解度、分配系数、挥发性、吸附性能等。3.目的产物特性产物的化学、物理和生物学特性，包括化学组成、相对分子量、等电点、电荷分布及密度、溶解度、稳定性、疏水性、扩散性、扩散系数、分配系数、吸附性能、生物学活性、亲和性、配基种类、表面活性等。基因工程药物的分离纯化4.产品质量的要求产品质量标准和用途对产品纯度、生物活性、比活的要求。包括允许的杂质种类和最大允许含量，特殊杂质的种类和最大允许量，以及杂质对使用的影响，产品剂型、贮存稳定性等。二．分离纯化的基本过程由于基因工程药物是从转化细胞、而不是从正常细胞生产的，所以对产品的纯度要求也要高于传统产品。基因工程药物的分离纯化一般不应超过4-5个步骤，包括细胞破碎、固液分离、浓缩与初步纯化、高度纯化直至得到纯化以及成品加工。基因工程药物分离纯化的一般流程各种组织细胞破碎方法细胞破碎方法组织种类细胞破碎方法组织种类旋刀式均浆大多数动、植物组织酶溶细菌、酵母手动式匀浆柔软的动物组织去垢剂渗透组织培养细胞超声破碎细胞浑浊液有机溶剂渗透细菌、酵母高压匀浆细菌、酵母、植物细胞低渗裂解红细胞、细菌研磨细菌、植物细胞冻融裂解培养细胞高速珠磨细胞混悬液三．分离纯化的技术分离纯化技术要求：⑴技术条件要温和，能保持目的产物的生物活性；⑵选择性要好，能从复杂的混合物中有效的地将目的产物分离出来，达到较高纯化倍数；⑶收率要高；⑷两个技术之间要能直接衔接，不需要对物料加以处理或调整，这样可减少工艺步骤；⑸整个分离纯化过程要快，能够满足高生产率的要求。1.细胞破碎与固液分离⑴细胞收集：离心和膜过滤⑵细胞破碎：机械法----高压匀浆、超声波、高速珠磨、高压挤压等。非机械法----酶溶、化学渗透、热处理、渗透压冲击法。⑶固液分离：分离细胞碎片是比较困难。一般用离心和膜过滤。2.目的产物的分离纯化分离纯化目的产物主要依赖于色谱分离技术。色谱技术分为：Ionexchangechromatography（IEC）Reversedphasechromatography（PRC）Hydrophobicinteractionchromatography（HIC）Affinitychromatography（AC）产物特征作用等电点决定离子交换的种类及条件疏水性与疏水、反相介质结合的程度特殊反应性产物的氧化、还原及部分催化性能的抑制聚合性是否采用预防聚合、解聚及分离去除聚合体生物特异性决定亲和配基溶解性决定分离提系及蛋白浓度稳定性决定工艺采用的温度及流程时间微不均一性影响产物的回收产物的主要特性及在分离纯化中的作用方法目的离心/过滤去除细胞、细胞碎片、颗粒型杂质阴离子交换层析去除杂质蛋白、脂质、DNA、病毒40nnm微孔膜过滤进一步去除病毒阳离子交换层析去除牛血清蛋白或转铁蛋白等超滤去除沉淀物及病毒疏水层析去除残余的杂蛋白凝胶过滤与多聚体分离0.22μm微孔膜过滤除菌基因工程药物生产中常用的分离纯化方法四．分离纯化工艺应遵循的原则⑴具有良好的稳定性和重复性；⑵尽可能减少组成工艺的步骤；⑶组成工艺的各技术或步骤之间要能相互适应和协调，工艺和设备相适应。⑷在工艺过程中尽可能少用试剂，以免增加分离纯化步骤，或干扰产品质量；四．分离纯化工艺应遵循的原则⑸分离纯化工艺所用的时间尽可能短，尤其是对稳定性差的产物；⑹工艺和技术必须高效，收率高，易操作，对设备条件要求低，能耗低；⑺具有较高的安全性针对不同的产物表达形式采用不同的策略采用分泌型战略表达重组蛋白，通常体积大、浓度低，因此应在纯化之前采用沉淀或超滤等方法先进行浓缩处理；采用包涵体型战略表达重组蛋白，应先离心回收包涵体；采用融合性战略表达重组蛋白，一般是胞内可溶性的，拟首先选用亲合层析进行纯化表达在细胞膜和细胞壁之间的间隙中的蛋白质，应用低浓度的溶菌酶处理，然后再用渗透压休克法释放重组蛋白。针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型等电点处于极端区域（pI≦5或pI≧8）的重组蛋白应首选离子交换法进行分离，这样很容易除去所有的杂蛋白；重组蛋白特异性的配体、底物、抗体、糖链等都是首选亲和层析纯化方法的重要条件，原则是它们与目标蛋白之间的解离常数应在合适的范围内（10-8~10-4mol/L）；针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型疏水层析和反相层析是根据蛋白质的疏水性差异进行分离的；凝胶过滤层析是根据蛋白的分子量和体积差异进行分离的；径向层析是近年来发展起来的集层析分离和膜分离于一体复合技术，在流量、负荷量等参数方面显示出极大的优越性。多种分离纯化技术的联合运用在进行重组蛋白的纯化时，通常需要综合使用多种技术，一般来说，在选择分离纯化方法时应遵循下列原则：应选择不同分离纯化机理的方法联合使用应首先选择能除去含量最多杂质的方法应尽量选择高效的分离方法应将最费时、成本最高的分离纯化方法安排在最后阶段分离纯化过程的规模化蛋白质分离纯化的实验室工艺、技术、方法在大规模产业化过程未必合适，如：实验室方法在工程上可能难以实现（超声波破细胞壁）实验室方法在大规模生产中可能成本过高（超速离心）因此，在很多情况下，实验室的技术路线不等于生产工艺包含体的形成：原核、酵母和真核生物由于异源和同源蛋白过表达所形成的致密的不溶性颗粒。包含体的形成与过表达蛋白的内在性质（如分子量、折叠途径等）无直接关系。因为大肠杆菌胞质环境是一个还原性环境，所以含有较多二硫键的蛋白较容易错误折叠形成包含体。相比之下，周质空间有利于二硫键的形成，但是包含体的形成也会发生。包含体的产生有利有弊。包含体的性质：致密：折光性；组成（几乎全部都是过表达蛋白，杂质主要是细菌外膜蛋白，离心时一起沉降）；通常对蛋白酶降解不敏感（发酵升温至42℃可促进包含体形成并进一步抑制蛋白酶）分离包含体并复性蛋白质的操作步骤并不复杂，从破碎细胞开始，然后将细胞匀浆离心，回收包含体后，加入变形剂溶解包含体，使之成为可溶性伸展态，再除去变性剂使表达产物折叠恢复天然构象及活性。但在实际研究中发现，在体外折叠时，蛋白质分子间由于存在杂粮错误折叠和聚合，复性效率往往很低。究其原因，蛋白质的立体结构虽然由其氨基酸顺序决定，然而伸展肽链折叠为天然活性结构的过程还受到周围环境的影响。一般认为，蛋白质在复性过程中，涉及两种疏水相互作用。一是分子内的疏水相互作用，二是部分折叠的肽链分子间的疏水相互作用。前者促使蛋白质正确折叠，后者导致蛋白质聚集而无活性，两者互相竞争，影响蛋白质复性收率。因此，在复性过程中，抑制肽链间的疏水相互作用以防止聚集，是提高复性收率的关键。包含体的分离、溶解和复性细胞破碎效率较重要（溶菌酶处理—高压匀浆）固-液相分离（离心）去污剂或/和低浓度尿素或盐酸胍洗涤，去可溶性蛋白和膜蛋白高浓度尿素或盐酸胍溶解包含体，可添加DTT(二硫苏糖醇)打开二硫键逐步透析或稀释去除变性剂透析或稀释速度，温度，pH，离子强度，目的蛋白的浓度（通常10-100微克/ml）以及目的蛋白中的杂质会影响复性过程，甚至导致目的蛋白聚集沉淀。对含有二硫键蛋白，采用谷胱甘肽、半胱氨酸和巯基乙胺（cysteamine）等还原剂打开二硫键，使用过量的氧化硫氨试剂或铜离子诱导的空气氧化可以加速二硫键氧化形成。复性过程添加L-精氨酸有时可以大幅度提高复性效率，可能是由于增加了复性中间体的可溶性。复性过程添加某些去垢剂可以提高复性效率。通过抑制分子间非特异性的相互的另一方法是使蛋白固定化（在亲和层析柱上复性）。避免或减少包含体形成的有效方法是减缓蛋白合成速率，如降低发酵温度、使用弱启动若启动子、降低基因剂量等。使用亲水性蛋白作为融合伴侣可以增加融合蛋白的可溶性，如谷胱甘肽硫转移酶（GST）、麦芽糖结合蛋白（MBP）和硫氧化还原蛋白（thioredoxin）后两者还具有分子内伴侣作用，在细胞内过表达分子伴侣蛋白，促进外源蛋白的正确折叠。过表达二硫键异构酶可以促使蛋白的正确折叠，大肠杆菌周质空间的DsbA蛋白的作用是引入新的二硫键，但是不催化异构，DsbC是一种二硫键异构酶。在培养基中加入硫醇也可以促进打开错配的二硫键，形成正确的折叠蛋白。常用的蛋白质、酶和重组蛋白质纯化技术分离原理分离方法特点用途分子大小凝胶过程分辨率适中；分级分离式流速较慢（﹥8h/循环）脱盐时流速快（30min/循环）；容量受限于样品体积分级分离、适于脱盐，大规模纯化的最后一步、用于去除杂质的聚合体；脱盐可用于任何阶段、特别是步骤衔接时的缓冲液更换电荷离子交换分辨率通常较高；流速较快（合适的填料）；容量很大，样品体积不受限最适于早期纯化，即大体积样品且蛋白纯度较低时使用等电点色谱聚焦分辨率较高；流速大；容量大，样品体积不受限纯化最后阶段疏水特性疏水作用分辨率较高；流速大；容量大，样品体积不受限适于任何阶段，特别适于样品离子强度较高，如沉淀，离子交换后反相分辨率较高；流速很快；容量大适用于最后阶段；特别适于分子量较小的肽生物亲和性亲和分辨率极高；流速大，容量大，样品体积不限适于任何阶段，特别是样品浓度小，杂质含量多时使用层析分离技术（chromatography）层析是广泛使用的分离蛋白质的方法，它是根据蛋白质的形态、大小和电荷的不同而设计的物理分离方法目前最常用的层析方法离子交换层析凝胶过滤层析亲和层析离子交换层析离子交换层析的基本原理离子交换介质的基本性质离子交换层析的基本操作离子交换介质的选择原则离子交换层析的基本原理离子交换层析（ion-exchangechromatography，IEC）IEC是以蛋白质分子净电荷和表面点和分布为分离基础的。具体说就是利用蛋白质带电性的差异，在离子吸附剂上静电吸附能力不同，用不同的pH/离子强度洗脱液洗脱，从而使蛋白质分离的柱层析方法。离子交换层析是以离子交换剂为固定相，以特定的含离子溶液为流动相，利用离子交换剂对待分离的各种离子结合力的差异，而将混合物中不同离子进行分离的层析技术。离子交换层析通过DEAE-纤维素将两种不同带电性的蛋白质分离开图中显示的是带正电的离子交换树脂结合带负电的蛋白离子交换介质的基本性质离子交换剂亦称离子交换介质，通常是一种不溶性高分子化合物，如树脂，纤维素，葡聚糖，醇脂糖等。离子交换剂中所含的可解离基团在水溶液中能与溶液中的其它阳离子或阴离子起交换作用如果有两种以上的成分被吸附在离子交换