基因测序

基因测序相关介绍基因测序简介•双脱氧链终止法测序•化学降解法测序•自动化测序•基因芯片测序双脱氧链终止法测(thechainterminationmethod)原理：核酸模板在聚合酶、引物、四种单脱氧碱基存在条件下复制或转录时，如果在四管反应系统中分别按比例引入四种双脱氧碱基，只要双脱氧碱基掺入链端，该链就停止延长，链端掺入单脱氧碱基的片段可继续延长。如此每管反应体系中便合成以共同引物为5’端，以双脱氧碱基为3’端的一系列长度不等的核酸片段。反应终止后，分四个泳道进行电泳。以分离长短不一的核酸片段（长度相邻者仅差一个碱基），根据片段3’端的双脱氧碱基，便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。O碱基CPOH12345O碱基CPHH12345H2OO碱基CPHH12345O碱基CPOHH12345OHXMaxam-Gilbert化学降解法测序基本原理：①用放射性核素标记待测DNA一侧末端②将标记DNA分为G、A+G、C+T、C4个反应体系③用不同的化学试剂处理不同反应体系，随机断裂DNA片段某种碱基中的任何一个，产生一组一端为放射线标记的末端，另一端为不同大小的DNA片段的混合物④电泳分离，放射自显影得到互相错落的梯形图谱，即可读出DNA序列作用的碱基试剂与反应碱基释放DNA断裂强G/弱A稀释250倍硫酸二甲酯，在50mM卡可酸（PH8.0）10MMgCl2、0.1MEDTA20℃60分钟，DNAG的N7和A的N3甲基化甲基化嘌呤不稳定，在中型PH加热被破坏在0.1M碱中，90℃15分钟，戊糖脱落，DNA链断裂，G断裂比A快5倍A同上0.2NHCl、0℃、60分钟，碱基被破坏同上，A断裂比G快C+T15-18M联苯胺、20℃50分钟，嘧啶环被破坏释放0.5M哌啶处理，断裂DNA键，C与T有同样速率C2MNaCl，联氨处理方法同上，100分钟，此时，T的破坏被抑制，只有C被破坏释放同上，只在C处断裂DNA链在4种反应体系中，化学试剂特异地断裂DNA的机制是：G反应----硫酸二甲酯（DMS）使GN7甲基化，其后断开了C8-C9间的化学键，哌啶置换了被修饰鸟嘌呤与核糖的结合。G+A反应----（哌啶）甲酸使嘌呤环上氮原子质子化，削弱了嘌呤脱氧核糖核苷酸和腺嘌呤脱氧核糖核苷酸的糖苷键，然后哌啶置换了嘌呤。T+C反应----肼断开了嘧啶环，产生碱基片段被哌啶置换。C反应----在NaCl存在时，只有C才能与肼发生反应，随后，被修饰的胞嘧啶被哌啶置换。★碱基特异性修饰及裂解反应体系碱基修饰试剂碱基修饰反应主链断裂试剂断裂点G硫酸二甲酯鸟嘌呤甲基化六氢吡啶GG+A甲酸脱嘌呤作用六氢吡啶G和AC+T肼嘧啶开环六氢吡啶C和TC肼（加盐）胞嘧啶开环六氢吡啶CMaxam-Gilber法所能测定的长度要比Sanger法短一些，它对放射性标记末端250个核苷酸以内的DNA序列效果最佳。Sanger法需要单链模板和特异寡核苷酸，并需获得大肠杆菌DNA聚合酶IKlenow片段的高质量酶制剂，而Maxam-Gilbert法只需简单化学试剂。随着M13噬菌体和噬菌粒载体的发展，也由于现成的合成引物唾手可得及测序反应日臻完善，双脱氧链终止法如今远比Maxam-Gilbert法应用得广泛。然而，化学降解较之链终止法具有一个明显的优点：所测序列来自原DNA分子而不是酶促合成所产生的拷贝。因此，利用Maxam-Gilbert法可对合成的寡核苷酸进行测序，可以分析诸如甲基化等DNA修饰的情况。由于Sanger法既简便又快速，因此是现今的最佳选择方案。事实上，目前大多数测序策略都是为Sanger法而设计的。DNA自动化测序特点原理同末端终止法标记物为荧光染料激光扫描自动测序结果清晰、准确、分辨率高测序速度快200bp/h芯片测序原理：杂交测序方法，即通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法。在一块基片表面固定了已知序列的八核苷酸的探针，当溶液中带有荧光标记的核酸序列TATGCAATCTAG，与基因芯片上对应位置的核酸探针产生互补匹配时，通过确定荧光强度最强的探针位置，获得一组序列完全互补的探针序列。据此可重组出靶核酸的序列。1ATACGTTA2GTTAGATC3ACGTTAGA4CGTTAGAT5GTTAGATCDNA样品TATGCAATCTAG与基因芯片上65,000种可能的八聚体进行杂交从而形成特定的结合图形计算机分析杂交图象并由探针的重叠情况推导样品的核酸序列1ATACGTTA3TACGTTAG4ACGTTAGA2CGTTAGAT5GTTAGATC3TACGTTAG4ACGTTAGA2CGTTAGAT互补序列为：ATACGTTAGATC样品序列为：TATGCAATCTAG第二代测序技术对于肝细胞癌的研究——外显子测序及转录组测序的发现及验证1.对肝癌患者的癌组织和癌旁组织进行全外显子和转录组测序,对数据进行分析、筛选;2.应用real-timePCR方法对测序以及芯片分别筛选出的拷贝数改变的区域进行进一步验证;对筛选出拷贝数扩增的区段进一步进行组织水平的免疫组化验证;3.扩大real-timePCR验证样本量,并对样本病历资料及部分样本的预后资料进行收集、整理和统计;4.对转录组测序筛选出的位于基囚组拷贝数扩增区域的融合基囚进行了常规测序的验证,并且通过5‘及3’-cDNA末端快速增技术(rapid-amplificationofcDNAends,RACE)得到了融合基因的全长并进行了部分功能实验;5.对比SNP6.0芯片技术和二代测序技术对CNV筛选的准确性;6.验证了部分转录组测序中的发现。论文举例RT合成cDNA第一链总RNA(1μg/μL)2μldNTPs(10mmol/L)1μl随机引物(randomprimer)(50ng/μl):1μl水6μl65℃5min冰浴至少2min10xRTbuffer2μl25mMMgCl24μl0.1MDTT2μlRNaseOUT(40U/μl)1μlSuperScriptⅢRT(200U/Ⅲ)1μl25℃10min50℃50min85℃5minReal-TimePCR步骤:RT产物0.5μlUp-Primer(10μM)0.5μlDown-Primer(10μM)0.5μlSYBRGreen10μl水8.5μl二代测序技术与芯片技术的比较通过SNP6.0芯片技术对测序的九对样本中的五对进行了检测,测序与芯片筛选出相同的拷贝数改变的区域有255个,而两种技术单独发现的区域差别很大,芯片技术共发现有9163个区域,而测序技术只有197个区域,进一步通过定量PCR检测表明,在芯片技术单独发现的区段中只有5.95%得到了验证,而在共同发现和测序技术单独发现的区段中,这-数掘分别达到了41%和27.4%这表明了测序技术较之芯片技术的准确性较高,尤其是单个基因的扩增和缺失,另外也同样说明两种技术都会在检测中都会有所遗漏。此外,我们通过同一基因不同外显子检测结果还找到了一些基因的断点，同时也提不了只有通过外显子捕获技术才能对单个基因的每个外显子进行扩增或缺失的检测。