基因测序案例

分析草案项目名称：西北农林科技大学18个花绒寄甲转录组+18个小RNA+6个蛋白定量分析（iTRAQ)测序及分析合同（无参考基因组）委托人（甲方）：西北农林科技大学林学院受托方（乙方）：签订地点：签订日期：年月日有效期限：年月日至年月日11．项目描述1）材料说明：研究对象为花绒寄甲（Dastarcushelophoroides），实验方案是对4龄期L1、6龄期L2、蛹期L3、1年成虫L4、2年成虫L5、4年成虫L6共6个时间点（每个时间点有3个生物学重复）的样本进行18个转录组测序、18个SmallRNA测序、6个ITRAQ蛋白定量实验。其中，转录组、SmallRNA测序使用同一样品。2）项目背景信息与项目策略3）测序数据分组、合并及符号发育节点:4龄期L16龄期L2蛹期L31年成虫L42年成虫L54年成虫L6原始重复数据：(1-3)(1-3)(1-3)(1-3)(1-3)(1-3)mRNA合并数据：X1X2X3X4X5X6X1-X6合并=T↓↓↓↓↓↓7组拼接数据：X1●X2●X3●X4●X5●X6●X1●-X6●合并=T●蛋白质翻译库X1d●X2d●X3d●X4d●X5d●X6d●Td●按照链特异性文库建库strand-specificRNAsequencing(DirectionalRNA-Seq)SmallRNA合并：Y1Y2Y3Y4Y5Y6Y1-Y6合并=U↓↓↓↓↓↓↓注释比对库Y1Y2Y3Y4Y5Y6U蛋白质组数据：D1D2D3D4D5D6D1-D6合并=V↓↓↓↓↓↓↓注释比对库D1D2D3D4D5D6V对比15次：L1-L2，L1-L3，L1-L4，L1-L5，L1-L6；L2-L3，L2-L4，L2-L5，L2-L6；L3-L4，L3-L5，L3-L6；L4-L5，L4-L6；L5-L624）原始数据：每发育节点转录组3组重复数据；SmallRNA的3组重复数据；蛋白组学1组数据。合并数据：3个原始重复测序数据合并为1组再组装、mapping。转录组X1～X6，组装库X1●～X6●；SmallRNA为Y1～Y6；蛋白质组为D1～D6。总数据：转录组X1～X6合并为T、组装库T●、再mapping，；SmallRNA的Y1～Y6合并为U、再mapping；蛋白组学D1-6合并为V、再mapping，转录组蛋白翻译库W。5)经费包括测序及以下所有信息分析费在内，信息分析费不再另行支付。1）材料说明：研究对象为花绒寄甲（Dastarcushelophoroides），实验方案是对4龄期L1、6龄期L2、蛹期L3、1年成虫L4、2年成虫L5、4年成虫L6共6个时间点（每个时间点有3个生物学重复）的样本进行18个转录组测序、18个SmallRNA测序、6个ITRAQ蛋白定量实验。其中，转录组、SmallRNA测序使用同一样品。2）项目背景信息与项目策略3）测序数据分组、合并及符号发育节点:4龄期L16龄期L2蛹期L31年成虫L42年成虫L54年成虫L6原始重复数据：(1-3)(1-3)(1-3)(1-3)(1-3)(1-3)mRNA合并数据：X1X2X3X4X5X6X1-X6合并=T↓↓↓↓↓↓7组拼接数据：X1●X2●X3●X4●X5●X6●X1●-X6●合并=T●蛋白质翻译库X1d●X2d●X3d●X4d●X5d●X6d●Td●按照链特异性文库建库strand-specificRNAsequencing(DirectionalRNA-Seq)SmallRNA合并：Y1Y2Y3Y4Y5Y6Y1-Y6合并=U↓↓↓↓↓↓↓3注释比对库Y1Y2Y3Y4Y5Y6U蛋白质组数据：D1D2D3D4D5D6D1-D6合并=V↓↓↓↓↓↓↓注释比对库D1D2D3D4D5D6V对比15次：L1-L2，L1-L3，L1-L4，L1-L5，L1-L6；L2-L3，L2-L4，L2-L5，L2-L6；L3-L4，L3-L5，L3-L6；L4-L5，L4-L6；L5-L64）原始数据：每发育节点转录组3组重复数据；SmallRNA的3组重复数据；蛋白组学1组数据。合并数据：3个原始重复测序数据合并为1组再组装、mapping。转录组X1～X6，组装库X1●～X6●；SmallRNA为Y1～Y6；蛋白质组为D1～D6。总数据：转录组X1～X6合并为T、组装库T●、再mapping，；SmallRNA的Y1～Y6合并为U、再mapping；蛋白组学D1-6合并为V、再mapping，转录组蛋白翻译库W。5)经费包括测序及以下所有信息分析费在内，信息分析费不再另行支付。2．目标及技术内容(流式细胞仪预测该虫基因为235M，已完成了1个成虫样2G转录组测序，注释率80%)（1）Hiseq2000完成18个（花绒寄甲Dastarcushelophoroides）RNA样品链特异性转录组测序,每个样品产生4Gbcleandata以上，并完成相应的信息分析。Q2095%以上，Q3090%以上（2）Illumina完成18个（花绒寄甲Dastarcushelophoroides）RNA样品SmallRNA测序（包括miRNA，rRNA，tRNA，snRNA，piRNA，snoRNA，microRNAs，siRNA，miRNAs等），保证每个样本产生不低于15～20M的cleanreads，并完成相应的信息分析。Q2095%以上，Q3090%以上（3）运用iTRAQ技术，完成6个样品的蛋白组学定量分析。对6个（花绒寄甲Dastarcushelophoroides）样品进行标记，将液相色谱与质谱联用，保证每个样本产生的蛋白质数不少于转录组注释数据量的1/10、鉴定非冗余蛋白质数不少于转录组数据量的0.6/10（果蝇9124个），通过生物信息分析鉴定蛋白和比较差异蛋白的表达量，并完成相应的信息分析。3．转录组技术路线3．1项目描述对18个RNA样品进行检测，样品检测合格后采取以下技术路线对转录组进行测序：常规转录组测序样品制备――上机测序（每个样品产生4Gbcleandata）――生物信息学分析。发育节点:4龄期L16龄期L2蛹期L31年成虫L42年成虫L54年成虫L6原始重复数据：(1-3)(1-3)(1-3)(1-3)(1-3)(1-3)mRNA合并数据：X1X2X3X4X5X6X1-X6合并=T7组组装数据：X1●X2●X3●X4●X5●X6●X1●-X6●合并=T●功能注释√√√√√√√ORF/CDS预测√√√√√√√SSR/SNP分析√√√√√√√lncRNA预测√√√√√√√蛋白质翻译库X1d●X2d●X3d●X4d●X5d●X6d●Td●按照链特异性文库建库strand-specificRNAsequencing(DirectionalRNA-Seq；trinity组装对比15次：X1-X2，X1-X3，X1-X4，X1-X5，X1-X6；X2-X3，X2-X4，X2-X5，X2-X6；X3-X4，14X3-X5，X3-X6；X4-X5，X4-X6；X5-X61）项目分析流程（1）转录组denovo组装单独拼接：每个发育时期3个生物学重复样本测序数据合并为1组后进行链特异性组装。六个发育时期转录组数据X1～X6，按照链特异性文库进行组装获得6个转录本(Ttranscript)，之后使用CD-HIT软件聚类获得各自的Unigene。（2）混样拼接：将六组不同发育时期，三次生物学重复的样本测序数据合并为T,通过拼接组装为大转录本T●(Ttranscript)，使用CD-HIT软件聚类获得其的Unigene。（3）组装结果评估：将组装得到转录本与NCBI中该物种或近源物种的已知序列（转录本或基因组）进行比对，评估组装结果。2）功能注释将通过拼接获得转录本X1●-X6●、T●的蛋白数据库（nr、Swiss-Prot、IPR、TrEMBL、KEGG和KOG等数据库）进行比对，通过被比对序列的相似行进行功能注释。3）KEGG注释转录组的KEGG注释主要是对得到的基因注释进行KEGGPathway分析，此分析是基于预测得到ORF序列，利用KAAS预测得到对应的KO号，然后利用KO号对应到KEGGpathway上，分析基因与KEGG中酶注释的关系文件以及映射到pathway的信息。4）GO注释5）KOG分类6）预测编码蛋白框CDS（ESTScan预测）7）转录本的可变剪切异构体isoforms分析8）转录本SSR和SNP分析9）lncRNA的预测将未比对上蛋白数据库的序列作为lncRNA的预测候选序列，与已知lncRNA数据比对进行预测。10）mRNA表达分析将使用T●为参考序列，将18个样本（六个发育时期三次生物学重复）的原始数据reads分别mapping到T●序列上进行基因表达定量分析。11）差异基因分析12）差异表达基因功能富集性分析（GO富集分析和KEGG代谢通路富集分析）13）时空表达顺序分析14）基因共表达网络分析15）补充说明：（1）以上1-9项分析项目7个转录本（X1●-X6●、T●）平行分析。（2）将使用T●为参考序列，将18个样本（六个发育时期三次生物学）的原始数据reads分别mapping到T●序列上进行基因表达定量分析。（同一个物种不同发育时期的基因组序列是一样，所以基因对应转录产物mRNA也是一致的。不同的发育时期只存在基因表达或不表达的情况。每个发育时期单独拼接的转录本只代表该时期的基因表达情况，而T●涵盖该物种6个时期所有基因表达情况。若某个时期有测序reads能mapping到T●的某个转录本，则表示该转录本有表达，否之则为不表达。）（3）后续蛋白定量分析，使用T●所对应的蛋白序列为Td●参考序列。3．2生物信息学分析内容注意：除常规分析项外，下述（也包含常规分析）必须全部做1．对原始数据进行去除接头序列及低质量reads的处理51）原始数据L1(1-3)、L2(1-3)、L3(1-3)、L4(1-3)、L5(1-3)、L6(1-3)测序产量统计2）L1(1-3)、L2(1-3)、L3(1-3)、L4(1-3)、L5(1-3)、L6(1-3)测序质量与测序错误测序质量Q与测序错误E；GC/AT碱基组成分布，原始数据处理后质量及碱基质量分布（fastqc工具）；测序饱和度分析测序饱和度分析图；rawdata产出统计，rawdata及cleandata的数据量及Q20、Q30统计，rawdata及cleandata测序质量分布图，duplicaterate统计3）测序随机性分析2.转录组组装与分析（可首选赤拟谷盗**Triboliumcastaneum、次选家蚕*Bombyxmori，或侯选黑腹果蝇Drosophilamelanogaster、冈比亚按蚊Anophelesgambiae、意大利蜜蜂Apismellifera、埃及伊蚊Aedesaegypti做参考靠基因，但公司在选择时必须慎重，一旦选定，后边其他分析所使用的参考基因组，也必须是该处所选定的种类；也可直接以T●作为参考基因，因为T●数据量肯定超过各个发育节点的数据量。不要求特别优异的结果）除常规程序性分析外，提供以下分析的数据及展示图：1）转录本N10/N20/N30/N40/N50/N60/N70/N80/N90的长度统计，绘制转录本长度分布图（1）X1●、X2●、X3●、X4●、X5●、X6●、T●转录本组装结果统计，必须提供数据库；（2）6个发育阶段X1●、X2●、X3●、X4●、X5●、X6●与T●组装结果之间的差异；2）转录本结合tgicl、cd-hit聚类（比对各样本reads到unigene。下述“7B”还要详细分析），提供分析数据及展示图（1）X1●、X2●、X3●、X4●、X5●、X6●、T●转录本聚类；（2）通过功能注释寻找X1●、X2●、X3●、X4●、X5●、X6●间的共有、特有基因。3）组装结果分析（可变剪切分析见下述3），提供以下分析数据及展示图：（1）常规程序性分析Contig长度分布、Transcript长度分