12.酶法分析课件分解

第12章酶法分析1.酶法分析的发展酶在定量分析中的应用可以追溯到19世纪中期。当时，曾采用麦芽提取物作为过氧化物酶源，以愈创木酚作为共底物或指示剂测定过氧化氢。•12.1概述早在1914年临床上就开始采用脲酶测定尿中的尿素，但是在临床实验室中酶分析的真正突破要推迟到1958年，当时转氨酶分析发展成为诊断肝病和心脏病的一个有效手段。到了20世纪50年代前已有60种物质能借助于酶法分析。近年来，酶法分析发展迅速，广泛应用于临床检验、食品、环境、生物及其它样品的检测。2.酶法分析的特点及应用类型酶的特性酶法检测的特点催化效率高专一性灵敏性强快速特异性、准确不需要物理分离，干扰少12.2酶法分析的方法及应用示例一.酶活性的测定:1.初速率法2.固定时间分析法3.固定变化分析法4.偶联法5.分光光度法及荧光法6.电化学法7.其它方法酶法分析中，被分析的对象可以是酶、底物、底物类似物、酶的活化剂或抑制剂等。1.初速率法•一般采用过量的底物，使所有的酶的活性位点都被饱和。一般底物浓度为米氏常数的10倍以上，此情况下的酶的反应速率视为初速率，是最大反应速率的90%以上。（可用于米氏常数的测定）2.固定时间分析法（动力学研究方法）无连续检测设备时，采用间隔一定时间，取出一定体积反应液并终止酶作用进行分析。要求：酶活性在催化过程中几乎没变化；要采用使酶钝化的措施：一般用强酸、强碱、三氯乙酸、过氯酸或SDS使酶失活，也可以用加热的方法终止反应。3.固定变化分析法把酶活性与要产生一定的变化量所需的时间关联起来，即酶活性与产生一定的变化量成反比。例如pH的变化。4.偶联法测定酶的活性举例：葡萄糖+ATP葡萄糖-6-磷酸+ADP这个反应中没有明显的光谱性质的变化，无法对于酶活进行测定。但是，葡萄糖-6-磷酸+ADP是葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）的底物，并在NADP+（辅酶Ⅱ）存在下发生第二个酶反应。葡萄糖-6-磷酸+NADP+6-磷酸葡萄糖酸+NADPH+H+NADP+的最大紫外吸收在280nm，而NADPH的紫外吸收在340nm，可以测定。己糖激酶•将两个酶偶联起来以获得可被检测的信号G6PD要求：1.两个酶催化反映的条件具有相容性；2.指示反应在整个反应中是非限速步骤，可以通过加大指示酶的用量来达到。分光光度法利用底物与反应产物在紫外和可见光部分光吸收的不同，连续或测定反应一定时间内吸光度的变化。连续测定法适合于反应速度较快的体系；而固定时间法适用于一些反应速度较慢的体系。许多氧化还原酶都可以根据反应过程中混合物吸光度的变化测定其活性。荧光法酶反应的产物或底物之一有荧光或二者的荧光光谱不发生重叠就可以根据荧光的变化来测定酶的活性。由于酶分子中常有酪氨酸和色氨酸，它们具有紫外吸收及荧光，在底物的选择时要避开它们的干扰。电化学法电位计技术（如pH电极）对H浓度发生变化的酶促反应，在实际测定时要加入酸或碱以维持溶液的pH不变，这样才能使酶的活力不发生变化。而加入的酸或碱的速度就代表了酶促反应的速度。极谱法（有氧电极法）有些酶促反应中，由于氧气的生成或消耗，引起溶液中溶解氧浓度的变化，从而引起电极之间电流大小的变化，由此可以计算出酶的活力，如葡萄糖氧化酶催化的反应。比气压法灵敏，同时具有抗污染物干扰的特性其他方法量气法：用于反应底物或产物之一是气体的情况通过测量反应过程中气相的体积或压力的变化便可以计算出气体的释放或吸收的量。再根据气体的变化和时间的关系就可以确定酶的活力。优点：可以连续取得数据，以便了解整个酶促反应过程。缺点：灵敏度和准确度都较低其他方法量热法：用非常灵敏的量热计可以测定酶的反应速度。该法灵敏，无干扰有些反应的产物还可以与缓冲溶液发生二次反应继续放热，从而增加测定酶活力的灵敏度。二.酶法分析的应用类型酶活性的测定底物及底物类似物的测定活化剂和抑制剂的分析测定12.2.1酶活性的测定概述几种酶活力的测定方法概述酶的提取纯化酶活力的表示方法测定酶活力的四个操作步骤酶活力的概念酶活力：就是酶催化反应的能力。用酶促反应初速度(reactionvelocity或reactionrate)来表示，即酶催化反应速度愈快，酶的活力就愈高，速度愈慢，酶的活力就愈低。活力单位(U)与比活力其中一个称酶活力国际单位，规定为：在特定条件下，1分钟内转化1微摩尔底物，或者底物中1微摩尔有关基团所需的酶量，称为一个国际单位（IU，又称U）。另外一个国际酶学会议规定的酶活力单位是Kat，规定为：在最适条件下，1秒钟能使1摩尔底物转化的酶量。Kat和U的换算关系：1Kat=6×107U，1U=16.67nKat如何测定酶活力？以产物浓度对反应时间作图，可得到酶促反应速度曲线0时间注意：初速度的测定是关键，为什么？二.酶活力及其测定1.酶活力概念PC可见，反应速度只在最初一段时间内保持恒定，随着时间的延长，反应速度逐渐下降0原因底物浓度的降低、产物的增加造成的逆反应的加快产物的抑制作用酶本身逐渐失活二.酶活力及其测定1.酶活力概念PC常规测定酶活力的操作步骤：（1）对样品酶液进行适当稀释（2）进行酶促反应（3）测定反应量：一般是测定反应产物生成量。具体的方法根据被测物质的理化性质而定（4）计算酶活力（u/ml，u/g）测定反应量①如果反应物或产物光学性质变化明显，可采用紫外光、可见光、旋光或荧光等光学仪器进行测定②如果pH或电化学性质变化大，可采用酸碱滴定或电位滴定等方法测定③如果底物或产物能与另外的试剂进行显色或产生其它表观性状易检测的反应，则可取出一定的反应样液，通过化学反应显色等方法进行底物或产物变化量的测定。几种酶活力的测定方法淀粉酶活力的测定糖化酶活力的测定蛋白酶活力测定法淀粉酶活力的测定【原理一】两种淀粉酶具有不同理化特性，α-淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下迅速钝化；β-淀粉酶不耐热，在70℃下15min则被钝化。据此，在测定时钝化其中之一，就可以测定出另一种酶的活力，本实验采用加热钝化β-淀粉酶测出α-淀粉酶活力，再与非钝化条件下测得的总淀粉酶活力比较，求出β-淀粉酶活力。淀粉的水解产物麦芽糖及其它还原糖能与3,5-二硝基水杨酸试剂反应，使其还原生成红色3-氨基-5-硝基水杨酸。【原理二】利用淀粉与碘呈蓝紫色的性质，水解后呈碘液本身的红棕色。蓝色消失的速度与酶活力相关，在标准条件下通过测定反应后的吸光度计算其酶活力。糖化酶活力的测定原理一:固体曲糖化酶活力的测定，采用可溶性淀粉为底物，在一定的pH值与温度条件下，使之水解为葡萄糖，以斐林试剂快速法测定。原理二:葡萄糖含有醛基，可被次碘酸纳酸化后析出碘，再用硫代硫酸纳标准溶液滴定计算酶活力。蛋白酶活力测定法原理蛋白酶在一定的温度与pH下，水解底物酪蛋白，产生含有酚基的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸等）。酪氨酸在碱性条件下，还原Folin试剂，产生深蓝色钼蓝和磷钨蓝混合物，颜色深浅与酪氨酸浓度成正比。这样，可以利用测定蛋白酶在单位时间内催化酪蛋白产生酪氨酸的量来求得蛋白酶的活力。12.2.3底物及底物类似物的测定测定方法:一.终点测定法----又称为平衡法。一般要满足三个条件：（1）专一性的酶或酶制剂；（2）能够确定酶反应进行完全的条件；（3）反应量的变化可借助简便方法来测定。单酶反应测定法•终点测定法指示酶反应偶联测定法底物量减少产物量增加辅酶变化量脱氢酶为指示剂脱氢酶以外的酶作指示剂二.酶循环法:采用酶循环法使偶联反应中的一种产物积累放大，并测定积累的产物，其量大小直接与主反应中的底物量成正比，从而测得低浓度的底物。3.反应速率法：测初速率法、动力学测定法和指示剂酶偶联的测定待测物量的方法。4.酶电极法5.放射性同位素测定法：用同位素标记的酶与底物进行反应，所生成的放射性产物的含量与底物浓度成正比。1414CCASH00乙酰CA+L-肉碱乙酰-L-肉碱+C•CAT12.2.4活化剂和抑制剂的分析测定活化剂和抑制剂只影响酶的催化活性，所以必须用动力学方法来测定。本章作业题1.常规测定酶活力的操作步骤？2.试举例说明如何测定反应量？