大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备

大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备【实验目的】掌握用CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞的原理和方法。【实验原理】常态细胞不能摄入外部溶液中的DNA分子，所以要转化质粒DNA进入大肠杆菌，首先必须制备感受态大肠杆菌细胞。受体细胞经一定方法处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能够允许外源DNA载体分子通过的感受态细胞。【材料和试剂】DH5α菌株、液体LB培养基、0.1mol/L的CaCl2溶液、75%的甘油（以上试剂均需高压灭菌）【仪器设备】振荡培养箱、低温离心机、分光光度计、冰盒、不同型号的枪头及微量移液器等【实验步骤】1、将1ml新鲜的16h过夜培养物，转到100mlLB培养基中。于37℃振荡摇匀3h（旋转摇床200～300r/min），测量OD600nm=0.314。2、在无菌条件下，将1.5ml细菌培养液转移到冰预冷的Eppendorf管中，在冰上放置10min。3、于4℃用4000r/min离心10min。4、弃去上清液，将Eppendorf管倒置1min，使残留培养液流尽。5、各加150μL冰预冷的0.1mMCaCl2溶液重悬细胞，合并两管，冰浴10min。6、于4℃用4000r/min离心10min。7、弃上清，将Eppendorf管倒置1min，使残留的痕量培养液流尽。8、先加入800μL冰预冷的0.1MCaCl2溶液重悬细胞，再加入25μL预冷的75%的甘油，之后于-80℃贮存备用。【注意事项】1、制备过程均需在低温（4℃）下进行，应尽量避免处理的细胞升温或于室温放置过久，否则会严重影响感受态细胞制备的效果。2、操作过程需保证无菌状态，若不慎污染，则后续操作将无法正常进行。