TCID50的测定方法

TCID50可用Reed-Muench法、内插法、或Karber1、Reed-Muench法将病毒液在灭菌小试管内作连续的10倍稀释,即用1ml吸管吸取0.2ml病毒液,加入已装有1.8ml的hanks液或earle液的第一支小试管内,将混合液充分振荡,并另换1支新的1ml吸管,吹打混合后,吸取0.2ml移入第二管1.8ml的hanks液管中,更换吸管,如上充分振荡和吹打混匀后,再吸取0.2ml移于第三管。连续如此操作,即可作成连续的一系列10×稀释液。吸取每一稀释度的病毒液0.1ml,加入于小试管内已长成单层的敏感细胞培养物中,每个稀释度的病毒液接种4-10个细胞管。于37℃旋转或静置培养,逐日观察（一般需7-10天左右）,直至终点,也就是看到能够引起病毒增殖（根据细胞病变或血凝素测定等）的病毒最高稀释度。按表14-2所举例子（每个病毒稀释液接种8个细胞管）计算TCID50表14-2TCID50的测定和计算（Reed-Muench法）病毒液稀释度细胞管观察结果累计细胞官数细胞管总数出现CPE的细胞管所占的％出现CPE管不出现CPE管出现CPE管不出现CPE管10-18027027100（27/27）10-28019019100(19/19)10-3711111291.6(11/12)10-435461040(4/10)10-517113140.7(1/14)10-608021210(0/21)出现细胞病变（CPE）以及血凝素等的细胞管数分别列于表14-2的第二和第三列,它们的累计数分别列于第四和第五列（根据箭头所示方向）,第六列为细胞管总数,第七列为出现细胞病变的细胞管数占细胞管总数的百分率。可见该病毒株的TCID50在10-3（91.6％）和10-4（40％）之间,其确切稀释倍数可按下列公式计算：91.6（高于50％的百分数）-5091.6（高于50％的百分数）-40（低于50％的百分数）＝41.6/51.6＝0.8将由上式获得0.8加在高于50%死亡的稀释度的对数（3）上,因此该病毒的TCID50应是0.1ml10-3.8稀释的病毒液。查反对数得6310,即该病毒6310倍稀释液0.1ml等于1个TCID50。2、内插法在计算出表14-2第七列,即出现细胞病变的细胞管数的基础上,也可按内插法计算：91.6（高于50％的百分数）-40（低于50％的百分数）50（半数量的比率）-40（低于50％的百分数）＝（相应的病毒液稀释度的对数）-（-4）（40％相应的病毒液稀释度的对数）/TCID50的对数-（-4）（40％相应的病毒液稀释度的对数）解上式得TCID50的对数为0.8,结果与Reed-Muench3、Karber法按表14-3及5Karber公式计算TCID50效价：表14-3TCID50的测定和计算（Karber）病毒液稀释度出现CPE的细胞管（阳性管）的比率10-18/8＝110-28/8＝110-37/8＝0.87510-43/8＝0.37510-51/8＝0.12510-60/8＝0Karber公式为：lgTCID50＝L-d（s-0.5）其中L＝最高稀释度的对数；d＝稀释对数之间的差；s＝阳性管比率总和。所以,lgTCID50＝-1-1（3.375-0.5）＝-3.875故TCID50效价＝103.875计算结果与Reed-Muench法近似。应用组织培养细胞进行感染力测定,较实验动物的LD50测定简便的多。如果采用微量培养板培养细胞进行此项实验,更能大量节省人、物力。