药理实验设计

阿司匹林与可待因的联合镇痛作用研究张敏洁、于帆、罗欣然、宋毅涵、肖健林、唐广博、吴紫薇、郑惠玲、闫睿联系效果美国药典收载有复方阿司匹林胶囊，由阿司匹林、可待因和咖啡因组成，其中的阿司匹林和磷酸可待因的比例为25：1，临床用于各种疼痛和发烧，疗效较好。相同镇痛效果降低两药的使用剂量减轻了两药的副作用背景郑惠玲、是美国政府对药品质量标准和检定方法作出的技术规定，也是药品生产、使用、管理、检验的法律依据。NF收载了美国药典(USP)尚未收入的新药和新制剂。美国药典正文药品名录分别按法定药名字母顺序排列，各药品条目大都列有药名、结构式、分子式、CAS登记号、成分和含量说明、包装和贮藏规格、鉴定方法、干燥失重、炽灼残渣、检测方法等常规项目，正文之后还有对各种药品进行测试的方法和要求的通用章节及对各种药物的一般要求的通则。美国药典★一个国家记载药品标准、规格的法典，一般由国家药品监督管理局主持编纂、颁布实施，国际性药典则由公认的国际组织或有关国家协商编订。药典由国家药品监督管理局主持编纂、颁布实施，国际性药典则由公认的国际组织或有关国家协商订。制定药典是从本草学、药物学以及处方集的编著演化而来。药典的重要特点是它的法定性和体例的规范化。特点我们根据国外上市品种的处方比例设计了复方阿司匹林片，并通过几种动物模型对阿司匹林与磷酸可待困的镇痛协同作用进行了研究。阿司匹林可待因7阿司匹林的镇痛机制唐广博•阿司匹林主要是通过抑制前列腺素及其他能使痛觉对机械性或化学性刺激敏感的物质(如缓激肽、组胺)的合成，属于外周性镇痛药。PG是一族含有一个五碳环和两条侧链的二十碳不饱和脂肪酸，多种细胞都可合成。细胞中的花生四烯酸以磷脂的形式存在于细胞膜中。多种刺激因素可激活磷脂酶A，使花生四烯酸从膜磷脂中释放出来。游离的花生四烯酸经细胞微粒体内环氧酶（COX)的催化生成各种PG，其中PGE2主要参与疼痛的调节。COX是前列腺素类化合物生物合成的关键酶，在体内有两种同工酶：COX-1与COX-2，COX-1是结构酶，正常生理情况下即存在，主要介导生理性前列腺素类物质形成。COX-2是诱导酶，在生理状态下基本不表达，在炎性刺激（如发热）的刺激下大量生成，介导花生四烯酸转化产生的PGE2和PGI2，具有很强的制痛作用。可待因的镇痛机制•在体内存在有“抗痛系统”，它由脑啡肽神经元、脑啡肽及阿片受体共同组成。去极化或刺激脑啡肽神经通路可引起脑啡肽释放，并依赖于钙离子。在正常情况下约有20%～30%的阿片受体与脑啡肽结合，起着疼痛感觉的调控作用，维持正常痛阈，发挥生理性止痛机能，可待因的作用是激动阿片受体，激活了脑内“抗痛系统”，阻断痛觉传导，产生中枢性镇痛作用。•脊髓水平上的网状结构、丘脑、大脑皮层等均参与疼痛的调节机制，其通路复杂，也需要多种神经递质传递信号，在这些部位，阿片受体极为丰富，是可待因参与调节疼痛的重要基础。热板致痛原理于帆痛反应阈值：又称痛阈值，是疼痛刺激引起应激组织反应的最低值，为临界值的意思。也就是刺激生物体系时，虽然对小刺激不反应，但当超过某限度时就会激烈反应的界限值。是机体对外力刺激最大的承受能力，痛阈值越高，承受疼痛的能力越强，反之越弱。间接测量痛阈值提高是身体的正常调节机制，是合理的、有益的调节。痛阈值的提高，并不表示刺激也要相应增强。如果刺激量超出了正常范围，但尚未达到痛阈值，很有可能会在感觉不痛的情况下受伤。不可盲目用药将小鼠置于一定温度的热板上，热刺激小鼠足部产生痛反应，即舔足反应。以小鼠出现舔足的时间作用为痛反应指标，判断药物镇痛作用好坏。热板致痛法控温精确计时精确发热均匀选取生长状况相近且适于实验的小鼠并分组测定给药前各组动物的痛反应阈值分别给予不同剂量的阿司匹林、磷酸可待因和复方混合物热板测痛仪测其用药后痛阈值（指标）记录并分析思路实验动物、器材和药品肖健林实验动物：雌性昆明小鼠（18g—22g)一般实验选择小鼠的原因：1.哺乳动物，解剖和生理结构与人较相似2.体型小，饲养管理方便3.生长期短，成熟早，繁殖力强4.性情温顺，胆小怕惊，对环境变化敏感5.种系纯，容易作比较，可以排除不同种系的干扰因素选择昆明小鼠（Kunmingmice，KM小鼠）的原因：来源：1926年美国Rockfeller研究所从瑞士引入白化小鼠培育成Swiss小鼠。1944年3月17日由汤飞凡教授从印度Hoffkine研究所引进Swiss小鼠，饲养在昆明中央防疫处。由于该小鼠起初引入地是昆明，故称之为昆明小鼠。解放后中央防疫处迁回北京天坛，更名为卫生部生物制品研究所。1950年小鼠随之引到北京天坛（检定所现址），当时保种9对。1953年10月移至北京东郊，1954年扩种，相继引到其他单位，现已遍布全国各地。主要特性：KM小鼠是我国生产量、使用量最大的远交群小鼠。基因库大，基因杂合率高，我国学者已从KM小鼠远交群中先后培育出不少近交系小鼠。经50多年的选育，现在KM小鼠肿瘤自发率极低。不同地饲养的昆明小鼠封闭群的生长发育与繁殖性能存在一定差异，但其共同特点是抗病力和适应力很强，繁殖率和成活率高。它在我国生物医学动物实验中约为小鼠总用量的70%。选择雌性小鼠的一般原因1.雌鼠性情温顺，公鼠易打斗2.雌鼠免疫反应强本实验选择雌性小鼠的原因是？实验器材YLS-6B智能热板仪、1mL注射器、12号灌胃针头三个关键1.表面的导热性和光洁度2.温度控制3.计时的准确程度药品配制75mg/mL阿司匹林溶液、3mg/mL磷酸可待因溶液，两者按1：1体积比配制混合溶液（25:1）、生理盐水实验步骤与分组宋毅涵实验步骤与分组1）先测定给药前各组动物的痛反应阈值，选取体重在18g一22g，痛阈值在5～30s的雌性小鼠，随机分成15组,并编号1—20，每组20只小鼠。实验室温度控制在20℃～25℃。2）1-5组、5-10组、11-15组、15-20组分别注射0.10mL、0.20mL、0.30mL、0.40mL、0.50mL的阿司匹林溶液（50mg/mL）、磷酸可待因溶液（2mg/mL）、混合溶液（25：1）和生理盐水3）于给药后1h分别将各组小鼠置于55℃±0．5℃的热板测痛仪的金属板上，以舔后足作为痛反应指标，记录小鼠投入热板至舔后足的时间作为痛反庙闺值，以痛反应阈值超过60S作为有效指标，计数痛反应时间超过60s的动物数，小鼠捉拿从笼盒内将小鼠尾部捉住并提起，放在笼盖(或表面粗糙的物体)上，轻轻向后拉鼠尾，在小鼠向前挣脱时，用左手(熟练者也可用同一只手)拇指和食指抓住两耳和颈部皮肤，无名指，小指和手掌心夹住背部皮肤和尾部，并调整好动物在手中的姿势。•小鼠灌胃•1.准备灌胃针头。一般可以从市场上面买到，实在没有的话，可以用12号的针头，剪去针尖，用砂纸将头端磨平，也可以用。但是买的灌胃针头的头端用锡或者适宜的方法处理了针头的锐口，自己用砂纸不可能将所有的锐口都磨掉，用这样的针头灌胃，损失小鼠食道的可能性比较大。•2.抓住小鼠，使其头、颈和身体呈一直线。抓小鼠的动作很简单，左手的小指和无名指抓住小鼠的尾巴，另外三个手指抓住小鼠的颈部即可。因为小鼠始终在活动中，若一次抓的感觉不是很顺手，要放开重新抓，不要逞强进行下一步操作。•3.抓好小鼠就可以灌胃了，一般用1ml的注射器配灌胃针头。灌胃针头从小鼠的嘴角进入，压住舌头，抵住上颚，轻轻向内推进，进入食管后会有一个刺空感，进入食道后就可以推注药液了。•4.灌胃容积一般是0.1～0.2ml/10g，最大0.35ml/10g，每只小鼠的灌胃最大容积不超过0.8ml。结果分析张敏洁结果分析生理盐水（mg/kg）痛反应时间超过60S的动物数（只）镇痛有效率（%）表1.生理盐水灌胃小鼠热板致痛反应（n=20）结果分析阿司匹林（mg/kg）痛反应时间超过60S的动物数（只）镇痛有效率（%）表2.阿司匹林对小鼠热板致痛反应的镇痛作用（n=20）结果分析磷酸可待因（mg/kg）痛反应时间超过60S的动物数（只）镇痛有效率（%）表3.磷酸可待因对小鼠热板致痛反应的镇痛作用（n=20）结果分析复方混合物（阿司匹林：磷酸可待因=25：1）（mg/kg）痛反应时间超过60S的动物数（只）镇痛有效率（%）表4.复方混合物对小鼠热板致痛反应的镇痛作用（n=20）对比表1.表2.&表3.若复方混合物的镇痛有效率大于阿司匹林、磷酸可待因的镇痛有效率，则两种药物之间具有协同镇痛作用。若复方混合物的镇痛有效率小于阿司匹林、磷酸可待因的镇痛有效率，则两种药物之间具有拮抗镇痛作用。若复方混合物的镇痛有效率等于阿司匹林、磷酸可待因的镇痛有效率，则两种药物之间无相互作用。在对应药物剂量比条件下，比较镇痛有效率。结果分析受试药品名ED50（mg/kg）95%可倍限（mg/kg）阿司匹林磷酸可待因复方混合物生理盐水表5.阿司匹林、磷酸可待因以及两者的复方对小鼠热板致痛反应的镇痛ED50ED50：半数有效量。在量反应中指能引起50%最大反应强度的药量，在质反应中指引起50%实验对象出现阳性反应时的药量。LD50：半数惊厥量或半数致死量。（药物的ED50越小，LD50越大说明药物越安全。）95%可倍限：在此剂量范围内95%的实验对象出现阳性反应。注意事项选择雌性小鼠以避免雄性小鼠阴囊与Woolfe热板接触而影响实验结果为尽量减少个体差异，应事先筛选痛阈小于30秒的小鼠作为实验鼠实验室室温应在15℃左右，Woolfe热板温度55℃左右；痛阈超过60秒的小鼠应立即取出以免烫伤各组给药后观察痛阈的时间要一致吴紫薇可行性分析罗欣然1.本实验操作简单，不需要过多的专业操作技术；通过舔后足、扭体反应和痛反应时间作为效应指标，直观、易测；2.热板测痛仪能较精确地调定温度，且温度较恒定，不会因为温度过高而使小鼠提前死亡，同时能较少实验误差；3.阿司匹林和可待因有较好的镇痛作用，效果明显，而且有明显的浓度梯度差异，在本实验中能在较短时间内观察到随着浓度变化而变化的镇痛有效率。技术可行性1.本实验用的昆明种小鼠和Wistar大鼠容易购得、繁殖能力强，个体差异相对较小，适合用于本实验；2.阿司匹林和可待因是常用镇痛药，价格低廉，容易获得，可购置充足药品用于实验；经济可行性讨论&小结闫睿热板致痛模型主要用于筛选中枢性镇痛药，对于解热镇痛药的筛选可使用化学性致痛模型----扭体反应模型。扭体反应将某些化学物质，如强酸、强碱、钾离子、缓激肽等，涂布于动物的的某些敏感部位或腹腔注射。腹腔注射损伤物质引起受试动物腹痛，动物表现出“扭体反应”（即腹部内凹、躯干与后肢伸张、臀部高起）选取体重在18～22g的小鼠，雌雄各半，随机分成15组，每组20只动物。同上一实验方法给药，给药后30min腹腔注射0.6％的醋酸溶液0.2ml／只，记录15min内小鼠的扭体反应，以15min内小鼠不出现扭体反应作为镇痛有效指标，计数不扭体的小鼠数，计算药物镇痛的的ED50)并进行结果分析。实验步骤概述选取体重在18～22g的小鼠，雌雄各半，随机分成15组，每组20只动物。同上一实验方法给药，给药后30min腹腔注射0.6％的醋酸溶液0.2ml／只，记录15min内小鼠的扭体反应，以15min内小鼠不出现扭体反应作为镇痛有效指标，计数不扭体的小鼠数，计算药物镇痛的的ED50)并进行结果分析。实验步骤概述从以上结果可知，阿司匹林与磷酸可待因同用可降低两药对小鼠扭体反应抑制的ED50。但对这一模型的协同作用不如其他模型明显。THANKYOU