菌种选育方法1

生物工艺学2菌种选育(1)2学习目的理解菌种选育的原理掌握菌种选育的技术3菌种选育的意义发酵工业的发展除了发酵工艺和设备得以改进外，其决定因素是优良菌种的获得菌种选育提供各种类型的突变株:提高发酵单位，改进产品质量，去除多余的代谢产物和合成新品种微生物潜在资源的广泛利用和开发4主要内容菌种的来源生物物质产生菌的筛选微生物选择性分离的原理和发展重要工业微生物的分离菌种选育自然选育诱变育种抗噬菌体菌株的选育杂交育种原生质体融合技术DNA重组技术菌种保藏52.1菌种的来源生物物质产生菌的筛选微生物选择性分离的原理和发展重要工业微生物的分离62.1.1微生物——生物产物的来源微生物是各种生物活性产物的丰富资源。微生物的初级代谢产物，如氨基酸、维生素；微生物的次级代谢产物，如抗生素获得所需生物特性新产物的关键生物产物的来源——微生物的选择；采用什么样的筛选方案(检测系统)。筛选方法选择性灵敏度72.1.2微生物选择性分离的原理和发展介绍放线菌纲为主的分离方法原理的发展。选择性分离方法大致可分为五个步骤：含微生物材料的选择材料的预处理所需菌种的分离菌株的培养菌落的选择和纯化以上任何一个阶段都可引入选择压力：选择压力，或进化压力，可以被认为是外界施与一个生物进化过程的压力，从而改变该过程的前进方向。所谓达尔文的自然选择，或者物竞天择，适者生存，即是说，自然界施与生物体选择压力从而使得适应自然环境者得以存活和繁衍。8(1)含微生物材料的选择材料来源的广泛性特定环境压力下的材料更容易筛选到特定的微生物类群耐高温、嗜高温——温泉、火山口、海底热液喷口耐低温/嗜低温——海底、雪山嗜酸：矿山酸性废水脂肪酶产生菌：屠宰场土壤（光合细菌：池塘、污水处理厂）9特殊环境台北阳明山小油坑10极端环境微生物的代谢产物特殊环境微生物的开发利用11最适生长温度在90℃以上的微生物，被称做极端嗜热菌。20多个属，大多是古细菌，生活在深海火山喷口附近或其周围区域。嗜热菌的营养范围很广，多为异养菌，其中许多能将硫氧化以取得能量应用利用菌体发酵:有人用极端嗜热菌生产乙醇。利用菌体产生的酶:如用于PCR技术的TaqDNA聚合酶，是从嗜热古细菌Thermusaquaticus中分离出来的。为基因工程菌提供特异性基因极端嗜热菌(Thermophiles)MudVolcanoAreaThermusaquaticus12极端嗜酸菌(Acidophiles)生活环境pH值在1以下的微生物，往往生长在火山区或含硫量极为丰富的地区，多为古细菌，体内环境保持pH值7左右。能氧化硫。嗜酸菌往往也是嗜高温菌。Sulfolobusacidocaldarius应用脱除煤中的无机硫，处理含硫废气，改良土壤等。还有用于冶金，提取矿物等。SulfuricGeyserSulfuricHotSpring13极端嗜盐菌(Extremehalophiles)高盐度环境中的古细菌。生活在10%-30%的盐液中。应用生产聚羟基丁酸(PHB)、胞外多糖类物质(如EPS)等多聚化合物；除去工业废水中的磷酸盐、开发盐碱地、开发能源等。从利用嗜盐酶看，有利用生产SOD、胞外核酸酶、胞外淀粉酶、胞外木聚糖酶等。14极端嗜碱菌(Alkaliphiles)盐碱湖或碱湖、碱池中，生活环境pH值可达11.5以上，最适pH值8-10。应用如用耐碱蛋白酶和碱性纤维素酶作洗涤剂的添加成分；碱性淀粉酶用于纺织品退浆；用于皮革工业中的脱毛工艺以提高脱毛效率和质量；利用嗜碱菌进行苎麻脱胶。15极端嗜压菌(Barophiles)一般生活在深海底，能耐普通微生物不能忍耐的高压。低于0.4-0.5ＭPa则不能生长。美国发现的一些种能够生长在1.3-1.4ＭPa环境中。日本在3000-6000ｍ深的深海鱼类肠道内发现了极端嗜压菌。多为古细菌。应用日本发现的深海鱼类肠道内的嗜压古细菌，80%以上的菌株可以生产EPA和DHA，最高产量可达36%和24%。嗜压菌可以用于高压生物反应器。16极端嗜冷菌(Psychophiles)深海的极端嗜压菌往往也是极端嗜冷菌。在真核生物中也有一些嗜冷的真菌和藻类，它们在两极冰雪和高山雪坡上生长。极端嗜冷菌的最适生长温度一般为-2℃以上，高于10℃则不能生长。应用国内的应用报道较少。国外有人将嗜冷酶应用于洗涤剂中。17(2)材料的预处理热处理：减少细菌数量，因为许多放细菌的孢子和菌丝片断比G(-)细菌细胞耐热。同样也减少放细菌的数目；水样品的浓缩：滤膜过滤、离心；添加固体基质或喷淋可溶性养分，增加特定微生物的数量；或诱使特定微生物附着在固体基质上。黄瓜+菜园土——腐酶花粉+土壤——小瓶菌腐霉菌（Pythiumspp.）18材料的预处理19(3)所需菌种的分离适当的培养基：广泛使用的三种培养基为：几丁质培养基—土壤和水中的放线菌淀粉-酪素培养基——分离的放线菌种类与几丁质培养基相似，但菌落密度更大、色素更多，细菌容易生长。M3培养基——容易分离链霉菌以外的其他放线菌如红球菌。20所需菌种的分离（续）适当的pH条件大多数放线菌为中性，培养基pH为6.7-7.5。分离嗜酸性放线菌，pH4.5-5.0。加入抗生素抗真菌抗生素，对放线菌无影响；抗细菌抗生素同时影响放线菌数量，选择合适的抗细菌抗生素如新生霉素、亚胺环己酮能分离出普通高温放线菌。21菌种的培养培养的温度常温：25-30℃嗜热菌：45-55℃嗜冷菌：4-10℃培养的时间一般的嗜温菌链霉菌、小单胞菌7-14d嗜热菌1-2d长时间培养可能得到不寻常的菌种22菌落的选择菌落的选择非常重要，决定筛菌的成功以及使筛菌的效率。具体方法取决于筛菌的目的。常用方法：铺菌法：一个分离平板试验一种菌测定各个菌落的抗生素产生能力。缺点：菌落被污染。复印平板法：stamp法。将菌落复印在平板上的办法来研究它们对一系列试验菌的作用。缺点：对不长孢子的链霉菌不适用，也不适用于游动细菌的筛选。23放线菌的菌落特征放线菌菌丝相互交错缠绕形成质地致密的小菌落，干燥、不透明、难以挑取，当大量孢子覆盖于菌落表面时，就形成表面为粉末状或颗粒状的典型放线菌菌落，常有颜色。A：诺尔斯氏链霉菌；B：皮疽诺卡氏菌；C：酒红指孢囊菌；D：游动放线菌；E：小单胞菌；F：皱双孢马杜拉放线菌24产抗菌素的放线菌的菌落特征A：卡特利链霉菌；B：弗氏链霉菌；C：吸水链霉菌金泪亚种；D：卡那霉素链霉菌；E：除虫链霉菌；F：生磺酸链霉菌25印章复印菌落原始菌落产生抑菌圈试验菌平板复印平板法26未来的发展天然基质的选择：特定的天然环境必定有特定的微生物。重视微环境的变化，如厌氧微生物。富集技术的发展（1）分离前改变天然菌群的组成，利用微生物生理知识，如前体的加入可以富集合成相应次级代谢物的菌类。（2）恒化器（Chemostat)培养混合菌，富集目的菌。定向的分离培养基配方的选择取决于对微生物营养生理的了解程度和经验，以选择更合理的培养基配方。分子生物学技术的应用DNA杂交技术基因芯片的发展27空气调节器泵发酵液储液瓶781WaterLevel磁力搅拌器恒化器示意图282.1.3重要工业微生物的分离分离/isolation是指获得纯的或混合的培养物。筛选工业微生物首先就要分离到一个或多个菌株。接着筛选出能够产生所需要物质或具有某种生化反应的菌种。分离——鉴定29生长快，发酵周期短高产副产物少、产物容易回收原料利用广泛耐受前体物质，不当作一般碳源利用产生泡沫少抗噬菌体遗传稳定发酵菌种的要求30筛选菌株时应该考虑的指标菌的营养特征：廉价、来源广。菌的生长温度：高于40℃，降低冷却成本；提高反应速度；有时利于产物分离，如乙醇发酵，高温产物的蒸馏变得容易。菌对设备和生产过程的适应性。菌的稳定性。菌的产物得率和产物在培养液中的浓度容易从培养液中回收产物。产物的毒性。31（1）施加选择压力的分离方法A富集液体培养富集培养（enrichmentculture)指能增加混合菌群中所需菌株数量的一种技术。富集培养的关键是提高有利于所需菌株而不利于其他类型菌株生长的物理、化学条件。如营养、温度、酸度、溶解氧等当所需菌株大量生长，会改变培养条件，从而改变选择压力，使其他微生物也能生长。此时，需要转移富集培养物至新鲜培养基，重新建立选择压力。32嗜中温浸矿微生物富集温泉水样液体培养基配方：9k基本盐【（NH4)2SO43g/L；KCl0.1g/L；K2HPO40.5g/L；MgSO4.7H2O0.5g/L；Ca(NO3)20.01g/L】能源：液体培养以S粉做能源物质，设计S粉浓度分别为5g/L，Yeastextract浓度0.5g/L培养基pH值设置：分别用2.0、3.0、4.0进行实验培养条件：50度，200rpm。33利用不同菌株比生长速率与基质浓度的关系，改变稀释速率，控制基质浓度，达到筛选所需菌株的目的。比生长速率低的菌将最终被洗出（washout）.根据连续培养理论：细胞积累=生长量-流出量dX/dt=μ*X–D*X；μ比生长速率，D稀释率，X菌体浓度对于生长快的和生长慢的菌，必然存在一个基质浓度，使生长慢的菌的比生长速率稀释率，结果该菌被洗出。连续培养筛选菌株34假定连续培养的稀释率为D，微生物A、B比生长速率相等时，限制性基质浓度为S1：•当基质浓度S1，则μB大于μA，当μB=D，μAD，从而dA/dt0，结果A被洗掉而只留下B;•当基质浓度S1，则μB小于μA，当μA=D，μBD，从而dB/dt0，结果B被洗掉而只留下Y;•当基质浓度=S1，μB=μA=D，B，A混合培养。SS1连续培养筛选菌株（续）35在连续培养装置中建立选择环境（选择压力）如特殊的限制性底物，极端的培养环境等实现富集所需菌株的目的。欲筛选酵母，淘汰细菌，将pH调节至3~4；欲筛选耐高温微生物，在高温（50℃)条件下连续培养；欲培养降解PCP（五氯酚）的微生物，在基质中加入PCP。连续培养筛选菌株（续）36常用于分离某些酶产生菌，其选择性培养基常含有所需酶的基质，以促进酶产生菌的生长。如蛋白酶、脂肪酶。例：分离产生碱性蛋白酶的芽孢杆菌属土壤须经巴氏法消毒，以减少不产孢子的微生物。然后铺在pH9～10的琼脂培养基(含有均匀的不溶性蛋白质)表面。碱性蛋白酶产生菌能消化平板上的不溶性蛋白，产生一清晰圈。清晰圈的大小可以初步作为选择高产菌的依据。B固体培养基的使用37平板分离培养大肠杆菌平板菌落霉菌菌落裴氏着色芽菌的菌落细菌菌落38海洋微生物菌落硅酸盐细菌菌落39（2）随机分离方法大多数情况下，采用随机分离方法分离菌株。随机分离培养基制作原则：制备一系列培养基，其中有各种类型的养分成为生长限制因素（C、N、P、O）；使用一聚合或复合形式的生长限制养分；避免使用容易同化的碳源（葡萄糖）或氮源（NH4+），它们可能引起分解代谢物阻遏（与容易同化的碳源接触，而使酶合成速率相对降低的作用）；确定含有所需的辅因子（Co2+、Mg2+、Mn2+、Fe2+），以利于酶的活性；加入缓冲液减少pH变化。40抗生素产生菌的筛选检测潜在产生菌的拮抗能力平板法：抑菌圈法。快速、简便。液体培养基培养：培养液过滤液的抗菌活性。优点：与深层培养性能比较一致。缺点：要求较为复杂的设备、空间更大。专一的筛选技术：利用某种特殊用途的生物物质对某种酶的抑制作用，在体外进行筛选。如负责细菌细胞壁肽聚糖的交联的羧肽酶抑制剂的筛选。41药理活性化合物的筛选自20世纪60年代起,开始从微生物代谢产物中寻找具有除抗菌作用外的其它生理活性的物质，抗肿瘤抗生素、抗虫抗生素、抗病毒抗生素和农用抗生素等。微生物产物的获得体外对某种人体关键酶的抑制实