高效液相色谱分析方法中渔药残留样品处理研究进展

现代仪器()二○○九年·第六期8高效液相色谱分析方法中渔药残留样品处理研究进展石寅莹1梅媛2朱家文1张维冰2（1.华东理工大学 化学工程研究所 上海 200237）（2.华东理工大学 化学与分子工程学院 上海 200237）摘 要 鱼肉中超标残留药物严重威胁着人类健康，并影响鱼类食品进出口贸易，高效液相色谱法(Highperformanceliquidchromatography,HPLC)能够快速、灵敏、可靠地予以检测。本文介绍HPLC法检测药物残留过程中的样品处理方法，并对其在6种常见渔药(四环素类、氯霉素类、大环内酯类，磺胺类、喹诺酮类和硝基咪唑类)检测中的应用进行综述。关键词 高效液相色谱样品处理渔药前 言近年来，我国水产养殖业发展迅猛，由于养殖集约化程度提高，养殖病害日益严峻，各类药物在生产中广泛使用，水产品药物残留问题日益突出。为加大鱼的产量，养殖者常使用抗生素类药物(四环素、氯霉素类、大环内酯类等)及合成抗菌药物(磺胺类、喹诺酮类和硝基咪唑类)。这些渔药由于抗菌谱广、价格低廉等诸多优点而被广泛采用。但其在鱼体内的残留会使鱼类自身连同其食用者产生耐药性，有些残留药物将进一步破环养殖水体环境，而鱼的品质降低也直接影响到鱼食品进出口贸易——该问题已引起世界各国专家的密切关注[1~3]。在鱼体内残留的抗生素具有痕量、动态、浓度波动范围大、样品基质复杂且不确定、干扰物质多等特点，因此很大程度上不同于普通的药物分析，要求分析技术能同时满足灵敏度高、选择性、分离能力强、线性范围宽等特点。现有检测方法众多[4]，主要有微生物测定法、分光光度法、气相色谱法、高效液相色谱法、气质联用和液质联用等。其中，高效液相色谱(HPLC)具有灵敏度高、分离速度快、对抗生素残留能准确定量等优点，能满足检测要求。对大多数渔药而言，RP-HPLC是标准的分离方法，易操作，易获尖锐的峰形而分离效果良好。使用HPLC法检测残留药物通常需要经过样品处理、残留药物分离和检测三个步骤。由于分离和检测技术日臻完善，现代色谱仪器对一个样品的分析测定所需时间越来越短[5]；但样品制备过程所用的时间仍然很长，成为研究的瓶颈。在众多的样品前处理方法中，各种无(少)溶剂样品处理技术已成为仪器分析中主要的样品前处理方法。本文介绍国内外新兴样品处理技术，并对鱼肉中常见的抗菌类残留物的样品提取技术予以综述。1 样品处理方法简介样品处理过程一般包括样品的采集、提取、净化和衍生化[6]。测定鱼类抗生素残留的采样对象通常为鱼肉，采集后的样品应防腐存贮。通常采用液固提取(Liquid-SolidExtraction,LSE)法提取样品，一般使用水和酸化有机溶剂，以此达到同时脱蛋白和萃取抗生素的目的。常用提取方法有匀浆提取法、振荡法、索氏提取法等[7]。通常所得提取液中含有许多与待测组分溶解性相似的杂质或共萃物，需进行净化与浓缩。对于部分组分还需经过化学衍生化处理，使适合于特定分析条件的化合物[8]。近年来，一系列新兴处理技术正迅速崛起[9]，使传统的提取、净化和浓缩等步骤更加简捷，测量更准确。1.1 固相萃取类固相萃取(Solid-PhaseExtraction,SPE)是目前渔药残留分析中样品前处理的主要技术[10]。SPE法用固体物质作为萃取剂吸附液体样品中的目标化合物，将待测组分和干扰化合物分离，再用洗脱液洗脱，达到分离和富集目标化合物的目的。SPE既可用于复杂样品中微量或痕量目标化合物的提取，又可用于净化、浓缩或富集，仅需使用少量的有机溶剂，能净化小体积(50~100μL)样品，简化样品处理过程，降低费用。基质固相分散(MatrixSolid-PhaseDispersion,MSPD)技术避免使用萃取溶剂，是真正意义上的固相萃取，可同时分散和萃取固体、半固体样品。MSPD法采用小样品容量与少量固相吸附剂(通常使用C8或C18材料)一同研磨，得半干状态的化合9二○○九年·第六期综述与专论物作为填料装柱，再用不同的溶液淋洗柱子，将各种待测物洗脱下来。该技术浓缩传统的样品前处理中所需的样品匀化、组织细胞裂解、提取、净化等过程，避免样品中被测物的损失，操作简单且易实现自动化[11]。1.2 超临界流体萃取超临界流体萃取(SFE)是近30年发展起来的一种新型样品富集技术[12]，基于在临界点附近，流体温度和压力的微小改变均可导致其性质的显著变化，可用作溶剂进行物料萃取。超临界CO2是最为常用的萃取剂。该技术不使用或少量使用有机溶剂，环境友好，且萃取速度快、效率高、能耗少、成本低及安全性好，还可与HPLC等分析仪器离线联用。1.3 免疫亲和技术免疫亲和色谱技术(ImmunoaffinityChromatog-raphy,IAC)和多残留免疫亲和色谱(Multi-Immuno-affinityChromatography,MIAC)是目前净化和富集效能最强的样品处理技术。IAC根据分析物和其他所引起的抗体之间有选择的和可逆的相互作用从而从复杂样品基质中分离出分析物[13]，简化处理过程，大大提高选择性，使分析结果更加准确和可靠，特别适用于食品安全检测中的农药残留和兽药残留等检测限非常低的痕量检测。IAC正从离线分析向在线分析、从单残留分析向多残留分析发展。在其基础上，发展多残留免疫亲合色谱(MIAC)技术：将多种抗体或簇特异性抗体固定到一根柱子上，或将固定有不同抗体的不同柱子串联起来，同时对多种目标组分进行净化浓缩，使免疫分析技术实际具备处理复杂样品中多组分残留的能力。但两者均处于探索阶段[14]，尚不成熟。1.4 其他样品处理方法其他微波辅助提取、超声降解、气体萃取、膜萃取、快速溶剂萃取(AcceleratedSolventExtrac-tion,ASE)等无(少)溶剂萃取方法亦见报导[15]。其中，ASE是在提高温度(50~200℃)和压力(10~30MPa)的条件下，用有机溶剂萃取固体或半固体样品的自动化方法。提高温度可降低样品基质对分析物的作用，加快被分析物从基质中解析并快速进入溶剂，降低溶剂粘度利于溶剂分子向基质中扩散；提高压力可提高溶剂沸点，确保溶剂在萃取过程中始终保持液态。其突出优点是有机溶剂用量少、萃取速度快、回收率高。该法已被美国环保局选定为推荐的标准方法。上述处理技术较之传统处理技术优点显著，特别适用于大批量样品或多残留分析，以简化前处理过程、缩短前处理时间，达到提高检测效率的目的。2 常见渔药残留的样品处理和HPLC检测鱼类养殖者常用的抗生素类药物主要有四环素、氯霉素类、大环内酯类、磺胺类、喹诺酮类和硝基咪唑类等。在样品处理时，需要考虑组分的物理化学性质、存在状态、样品基质的化学组成、可能的干扰物质物类型、处理方法对组分稳定性的影响和采用的测定方法。方法是否理想要看药物组分添加回收率高低、干扰成分去除程度、提取步骤的繁简等因素来综合评定。样品处理方法涉及的因素很多，操作复杂，方法灵活，直接影响分析结果的准确性和精密度，以及方法的效率和成本，应合理选用。以下针对几类鱼类养殖中的常用抗生素的检测方法做综述。2.1 四环素类(TCs)四环素类抗生素(tetracyclines,TCs)是鱼类养殖中一类重要的抗感染药物，水溶性好、化学性质稳定、治疗效果好且成本低，可用于动物感染预防、治疗和饲料添加剂以促进其生长，尤以土霉素(oxytetracycline,OTC)、四环素(tetracycline,TC)、金霉素(chlortetracycline,CTC)和强力霉素(doxy-cycline,DC)应用最多[16]。但TCs易在骨骼和牙齿中沉积，亦可在肝组织中富集，造成肝损害。因此准确检测四环素类抗生素的方法尤其重要。我国国家标准《畜、禽肉中土霉素、四环素和金霉素残留量的测定(高效液相色谱法)》中[17]采用的样品处理和检测方法为：乙腈做提取剂，提取液经0.45μm微孔滤膜过滤。后用RP-HPLC法分离，经紫外检测器(UV)检测，三者的检出限分别为150μg/kg，200μg/kg和650μg/kg。常采用SPE和MSPD技术对于含TCs残留鱼肉样品进行处理，其检出限低于国家标准。CarignanG[18]等用1%偏磷酸提取鱖鱼肌肉中土霉素，正己烷萃取去除脂肪，检测限85μg/kg，定量回收率78.5%。杨挺[19]、黄志勇[20]等分别建立一种高效液相色谱法测定水产品中TCs分析方法，用5.0%高氯酸溶液提取样品，固相萃取柱净化上清液，紫外检测器于355nm测定。最低检出限可达10μg/kg，适用于水产品中四环素类抗生素残留的检测。刘丽[21]、王覃[22]等采用类似方法，分别用乙腈-柠檬酸溶液和乙腈-醋酸铵/醋酸/水缓冲液为流动相体系进行梯度洗脱，得到相现代仪器()二○○九年·第六期10似的检测结果。郭霞等[23]采用改进方法，使用5%高氯酸溶液振荡提取，离心后经滤膜过滤，检出限为土霉素50μg/kg，四环素50μg/kg，金霉素100μg/kg，避免相对繁琐的MCI缓冲溶液配置过程和SPE净化处理过程，使样品处理方法得到简化，且检出限稍高，低于国标检出限[24]。另有宋欢等[25]报导兔肉中TCs类药物的MSPD-HPLC-UV分析法。实验通过样品和C18填料研磨混合、装柱、淋洗、富集、RP-HPLC测定，可同时检测兔肉中4种TCs残留，检出限为10μg/kg，加标回收率为69.8%~103.1%。该法灵敏、准确、简便、检测限低，研究者认为该法可普遍适用于水产品中上述4种TCs残留的同时检测。2.2 氯霉素类(CAPs)氯霉素类抗生素(Chloramphenicols，简称CAPs)包括氯霉素及其衍生物，有氯霉素(Chloram-phenicol,CAP)、甲砜霉素(Thiamphnicol,TAP)、氟甲霉素(Florfenicol,FF)等。CAPs是一种强力广谱抗生素药品，人体若不断摄取将抑制骨髓功能，引起人类的再生障碍性贫血等疾病；还能引起视神经炎、皮疹等不良反应；低浓度药物残留会诱发致病菌的耐药性。世界粮农组织和卫生组织对食品中氯霉素的残留量作出严格的规定，我国农业部也于2002年正式将氯霉素及其盐酯等制剂列为禁用药。对此类样品处理必须仔细谨慎，以提高测定的准确性和灵敏度，可用传统方法或SPE法处理样品。Russel[26]首先报道HPLC法检测CAP残留。用乙腈和硫酸钠提取肌肉组织中的CAP，用正己烷去除脂类物质乙腈相浓缩后经HPLC分析，检测限为1.0μg/kg。陈眷华等[27]用乙酸乙脂超声波提取鱼肉中残留TAP，用正己烷去脂，流动相为甲醇-水，C18色谱柱分离检测，最低检测限为50μg/kg。赵芸等[28]用乙酸乙酯提取鱼肉样品中的FF，氮气吹干浓缩，液-液分离净化，经RP-HPLC法测定FF，最低检出浓度为50μg/kg。目前HPLC法检测CAPs灵敏度高、重复性好，假阳性少，但检出限高[29]。样品处理主要使用乙腈和乙酸乙酯，多用C18柱分析，而C8分析柱用于分析在C18柱上保留值低的化合物。在处理过程中还应注意样品和提取剂比例。黄志勇等[30]对市售罗非鱼、鳜鱼、黄鳍鲷、鲈鱼、小黄花鱼、大黄花鱼、鳗鱼等进行试验，指出当鱼浆和提取剂为5∶14时，氯霉素基本被提取完全，提取溶剂过多和过少则结果均不理想。2.3 大环内酯类(MALs)大环内酯类抗生素(macrolideantibiotics，MALs)是一庞大而重要的抗生素类群，目前已发现的达100多种，其共有的特征是抗革兰氏阳性菌活性、抗支原体活性和低毒性。MALs的高残留会对人类造成致敏性及毒性反应，会改变人体肠道菌群的微生态环境，造成肠道菌菌群失调，亦易导致细菌抗药性。世界各国对MALs的残留限量提出要求，并制定相应的残留监控计划。这类药残样品处理的基本方法为先用乙腈或甲醇提取，经正己烷洗涤脱脂，再经SPE净化。国外有快速溶剂萃取-加压液相萃取(ASE-PLE)法，可考虑采用。刘晔[31