Real-time PCR实验原理与技术

胡晓研究生实验技术2015-12-7qRT-PCR技术原理一、实验原理：在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光探针，利用荧光信号积累实时监测整个PCR反应进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。荧光信号+标准曲线定量分析？qRT-PCR技术原理a)Ct值(CycleThreshold;每个反应管中荧光强度达到阈值所需的循环数)与样本初始拷贝数存在正比线性关系。b)以不同稀释倍数的已知模板制备标准曲线。c)实时监测未知样本的Ct值，对应标准曲线得到未知样本的初始拷贝数。（定量分析）qRT-PCR技术荧光标记方法的分类1.非特异性的DNA结合染料法：荧光染料能非特异结合DNA双链结构的小沟中，而游离的荧光染料不发出荧光。常用染料：PicoGreen（灵敏度高,=25pg/mL）SYBRI缺点：易受到非特异性扩增和引物二聚体的影响。措施：设计特异性引物，优化PCR反应条件。qRT-PCR技术荧光标记方法的分类qRT-PCR技术荧光标记方法的分类2.特异性荧光定量PCR:以荧光共振能量转移原理为基础水解探针法分子信标Scorpion引物/探针复合探针qRT-PCR技术影响因素①样品RNA的完整性②RNA样品中的基因组DNA污染③特异性良好的引物④PCR反应体系的优化⑤反转录所得cDNA的量必须精确地等于相应的mRNA的量⑥可靠的内标基因：TEF-2qRT-PCR技术实验操作qRT-PCR技术实验操作阳性模板qRT-PCR技术实验操作1.制作标准品阳性对照：测定阳性模板的浓度，10倍稀释为1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104，以备用。2.反应体系如下:(标准品反应体系)序号反应物剂量1SYBRGreen1染料10μl2阳性模板上游引物F0.5μl3阳性模板下游引物R0.5μl4dNTP0.5μl5Taq酶1μl6阳性模板DNA5μl7ddH2O32.5μl总体积50μl3.轻弹管底将溶液混合，短暂离心。(内参照基因反应体系)序号反应物剂量1SYBRGreen1染料10μl2内参照上游引物F0.5μl3内参照下游引物R0.5μl4dNTP0.5μl5Taq酶1μl6待测样品cDNA5μl7ddH2O32.5μl总体积50μlqRT-PCR技术实验操作1、制备用于绘制梯度稀释标准曲线的DNA模板：①针对每一需要测量的基因，选择一确定表达该基因的cDNA模板进行PCR反应。序号反应物剂量110×PCR缓冲液2.5ul2MgCl2溶液1.5ul3上游引物F0.5ul4下游引物R0.5ul5dNTP混合液3ul6Taq聚合酶1ul7cDNA1ul8ddH2O9至25ul②轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。35个PCR循环（94℃1分钟；55℃1分钟；72℃1分钟）;72ºC延伸5分钟。③PCR产物与DNALadder在2％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。④将PCR产物进行10倍梯度稀释:将PCR产物进行10倍梯度稀释:设定PCR产物浓度为1×1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104几个浓度梯度。qRT-PCR技术实验操作待测样品的待测基因实时定量PCR:①所有cDNA样品分别配臵实时定量PCR反应体系。体系配臵如下：序号反应物剂量1SYBRGreen1染料10ul2上游引物1ul3下游引物1ul4dNTP1ul5Taq聚合酶2ul6待测样品cDNA5ul7ddH2O30ul总体积50ul轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。qRT-PCR技术实验操作上机前样本的制备检测程序的设置检测孔及相关参数的设置热循环参数的设置运行检测程序结果的显示与输出结果分析熔解曲线扩增曲线qRT-PCR技术实验操作qRT-PCR技术实验操作（优化）qRT-PCR技术实验操作（优化）qRT-PCR技术实验操作（优化）假阳性：荧光染料能和任何dsDNA结合，因此它也能与非特异的双链如引物二聚体或非特异性扩增产物等结合。要避免这些非特异荧光信号对定量精确性的影响，可以利用热循环仪内设定的熔解反应程序对扩增产物进行熔解曲线分析。熔解曲线峰为单一峰形，未见其他峰值，并且峰的形状也比较锐利。扩增产物特异性好。qRT-PCR技术实验操作（优化）有研究建议在每一个循环中PCR延伸后增加一步，即将温度提高后再检测反应体系中的荧光。该检测温度大于引物二聚体的退火温度Tm，而小于特异性扩增产物的Tm值。在此温度下，引物二聚体都变性成单链，因此只检测到与特异性PCR产物结合的SYBRGreenI所发出的荧光，消除了引物二聚体的干扰，降低了非特异性荧光，有助于目标基因的准确定量。qRT-PCR技术实验操作（优化）标准品的选择：理论上可以以目的基因的PCR扩增产物为标准品，但是存在降解、污染等因素影响定量结果。论坛网友给出了几种解决方法：①另设计一对引物用于荧光PCR；②将扩增序列插入T载体后作为标准品；③设计一对外围引物扩增PCR,将产物连入T载体(①+②)qRT-PCR技术实验操作（优化）1、同管扩增：减少操作误差，引物间影响大2、异管扩增：扩增结果真实可信，具有操作误差1.总RNA提取；2.模板cDNA制作；3.半定量PT-PCR：1.引物设计及选择：a)上下游引物设计在跨内含子的一个外显子的5’端和下一个外显子的3’端。b)设计在两个离得远的外显子上。2.引物的长度：严格配对17-19bp。最后一个碱基为C或G；GC含量为40％-60％之间。如此，管家基因与目的基因的退火温度基本一致。长度一般设计为350bp-600bp之间3.内参的选择4.同管扩增或异管扩增的选择5.PCR循环数的选择