目的基因获得

第三章目的基因获取教学目的了解获得目的基因的一般方法。掌握基于基因文库分离基因的方法，核基因库以及cDNA库的构建及筛选方法。重点与难点基因组文库及cDNA库的构建PCR方法筛选获得目的基因目的基因是所要研究或应用（分离、改造、扩增或表达）的基因，也就是将要克隆或表达的基因或基因的一个片段,相对宿主细胞称外源基因。获取目的基因是分子克隆中最重要的一步。目的基因制备的目的1.克隆特定的基因或cDNA；2.构建克隆或表达载体；3.构建基因文库，含：基因组DNA文库和cDNA文库。常用方法建立基因组DNA文库筛选目的基因构建cDNA文库筛选目的基因化学合成聚合酶链反应（PCR）方法扩增目的基因其他方法１基因文库(genelibrary)概念基因文库(library)又称DNA文库，是指某个生物的基因组DNA或cDNA片段与适当的载体在体外重组后，转化宿主细胞，并通过一定的选择机制筛选后得到大量的阳性菌落(或噬菌体)，所有菌落或噬菌体的集合即为该生物的基因文库。基因文库由外源DNA片段、载体和宿主组成。（一）基于基因文库的分离基因方法基因组DNA文库的类型根据所选用的载体可以分为：质粒文库、噬菌体文库、粘粒文库、人工染色体文库（细菌人工染色体文库、酵母人工染色体文库）。基因组DNA文库的质量标准一个理想的基因组DNA文库应具备下列条件：1重组克隆的总数不宜过大，以减轻筛选工作的压力2载体的装载量最好大于基因的长度，避免基因被分隔克隆3克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域，以利克隆排序4克隆片段易于从载体分子上完整卸下5重组克隆能稳定保存、扩增、筛选２基因组文库的发展上世纪70-80年代,研究一个基因到几个基因质粒载体、λ噬菌体载体、黏粒载体等（小片段低容量的载体）90年代后开始的一些生物的基因组测序研究构建一些生物的染色体物理图谱需要现在发展起来的直接转化植物的大片段文库载体人工染色体文库、亚基因组文库（大片段低容量的载体）３基因文库构建的基本程序（１）提取研究对象基因组DNA，制备合适大小的DNA片段，或提取组织或器官的mRNA并反转录成cDNA；（２）DNA片段或cDNA与经特殊处理的载体连接形成重组DNA；（３）重组DNA转化宿主细胞或体外包装后侵染受体菌；（４）阳性重组菌落或噬菌斑的选择。基因组DNA文库的构建流程载体的制备高纯度大分子量基因组DNA的提取高纯度大分子量基因组DNA部分酶切和电泳分级分离外源DNA片段的连接转化或包装侵染重组克隆的挑取和保存基因组DNA文库限制性内切酶基因组DNA基因重组转化细菌体外包装3.1载体的制备载体的好坏是影响连接成功与否的关键，载体的制备要求两点，一是纯度高；二是去磷酸化好。3.2高纯度大分子量基因组DNA的提取和部分酶切构建不同大小插入片段的基因组文库对DNA质量要求不同，一般所提取的DNA分子量至少应该是文库最终平均插入片段长度的3～5倍。实践表明，提取的基因组DNA分子量越大，所得到的重组克隆的插入片段越大。3.3外源DNA片段的连接转化或包装侵染将一般在构建大片段基因组DNA文库时，大量连接前都要先使用小体系连接来寻找最适的比例。在电转化和包装侵染过程中，首先最好选择转化效率高的进口感受态细胞或效价高且质量稳定的包装蛋白，同时，研究表明对连接产物进行脱盐处理也可以明显地提高其效率。另外，对于电转化而言，选择合适的转化电压对不同插入片段的DNA的转化效率也有所不同。3.4文库的质量检测在文库的质量检测中，除了克隆子数目是可以确定的，其它值都是估算的。文库的平均插入片段长度是通过电泳检测一定数目的重组子的插入片段大小所得平均值。一般要求植物的在130kb左右，而动物的在150kb左右。插入效率也是通过此法检测的，表示有插入片段的克隆在所有检测的克隆中所占的比例。基因组覆盖度是指文库中的克隆覆盖基因组的范围，检测时是通过选择一定数目的已知的单拷贝的基因作探针来筛选文库。４原核生物基因组DNA文库的构建（一）原核生物基因组DNA的提取染色体DNA质粒DNA要求：制备的DNA的长度为100-200kb，防止在制备过程中的机械断裂（二）基因组DNA的不完全酶切1、根据实验需要选择合适的限制性内切酶a)四个识别位点的限制酶出现的几率:1/256b)六个识别位点的限制酶出现的几率:1/10242、分离目的酶切片段大小的确定a)克隆单个基因：10kbb)克隆基因簇：20kb3、DNA不完全酶切条件的确定a)确定限制酶用量，改变酶切时间b)固定酶切时间，改变限制酶的用量DNA的不完全酶切（三）酶切片段与克隆载体连接１、酶切片段的分离与纯化１）低熔点琼脂糖回收目的片段２）试剂盒回收目的片段2、酶切片段与克隆载体连接克隆载体的选择a）质粒载体可承载15kbDNA左右片段(有效的范围为10kb)b）载体可承载25kbDNA左右片段(有效的范围为15kb)c）Cosmid载体可承载45kbDNA左右片段(有效的范围为40kb)（四）重组ＤＮＡ转化受体细胞１、根据克隆载体的性质选择合适的受体细胞常见的宿主细胞：DH5:用于铺制与培养质粒平板和粘粒平板的重组缺陷型的抑制型菌株，可与PUC编码的－半乳糖苷酶氨基端实现互补。HB101:用于大规模制备质粒的抑制型菌株，转化效率高JM101:可支持带有琥珀突变载体生长的宿主菌JM109:支持带有琥珀突变载体生长的重组缺陷的抑制型菌MZ-1:温度敏感的溶源性菌株，用于含有噬菌体ＰＬ启动子质粒载体的宿主菌２、重组质粒转化受体细胞1）转化法(transformation)2）转导法(transduction)3）转染法(transfection)（五）基因组DNA文库克隆子的保存1、基因组DNA文库的保存1)影印膜滤保存法2）文库在液体培养基中扩增保存方法：从琼脂糖平板上挑取已长出的克隆子转入含适当的抗生素培养基中，混合的细菌生长数代后，其培养物于-70℃储存（加终浓度为25%的甘油）。缺点：因文库菌落生长的不均匀性而导致文库中某些特定的序列过多或过少。3)保存单个克隆子于含有甘油的培养基中方法：从平板上挑选单个克隆子接种于合适的含抗生素的培养基中，菌体生长到一定浓度后，加入终浓度为25%的甘油，于-70oC或-25oC下保存。缺点：需保存的克隆子数过多，工作量大？真核生物基因组文库的构建与原核生物基因组文库的构建有何不同cDNA是由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的mRNA经体外反转录后形成的双链DNA。cDNA文库代表生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内转录水平上的基因的群体，并不能包括该生物的全部基因，且这些基因在表达丰度上存在很大差异。（二）基于cDNA库的分离基因方法１cDNA基因文库构建的步骤细胞总RNA的提取和mRNA的分离第一条cDNA合成第二条cDNA合成双链cDNA克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖cDNA文库的构建：基因重组反转录酶mRNAcDNA1.1细胞总RNA的提取和mRNA的分离通常用于构建cDNA的是真核细胞的mRNA，由于cDNA从mRNA合成而来，代表了基因组的可转录部分，不含内含子序列，因此可被用于在大肠杆菌中表达编码蛋白。由于每类细胞和组织只表达一套特定的基因，因此从特定组织中制备的mRNA通常会富集某些特异序列。所以起始材料的选择十分重要。1、mRNA的制备:动物细胞或植物细胞mRNA的制备2、mRNA的来源:选用mRNA含量高的组织材料，或通过药物等方法提高mRNA的含量。3、mRNA完整性的检测1)mRNA分子的大小：哺乳动物mRNA长度为500-8000bp，大部分mRNA位于1.5-2.0kb之间.2)总mRNA指导合成cDNA第一链长分子的能力4、mRNA在细胞中的丰度1)高丰度mRNA目的mRNA在细胞中的含量占细胞质总mRNA量的50-90%,该类mRNA在合成和克隆cDNA之前不需进一步纯化特定mRNA。2)低丰度mRNA目的mRNA在细胞中的含量占细胞质总mRNA量的0.5%以下。5、mRNA的富集方法典型的哺乳动物细胞含有10,000-30,000种不同的mRNA分子,某些mRNA分子在细胞内的拷贝数很低甚至只有一个拷贝。1)按大小对mRNA进行分级分离*通过琼脂糖凝胶电泳分离大小不同的mRNA分子，该方法的分离效果最好，但从凝胶中回收的得率较低.*蔗糖梯度离心：加入破坏RNA二级结构的变性剂如氢氧化甲基汞等，再进行蔗糖梯度离心以分离不同分子量的mRNA.2)cDNA的分级分离*mRNA通过反转录形成cDNA，在插入到克隆载体前，通过琼脂糖凝胶电泳，将不同大小的cDNA分子分离开来。*优点：a）避免了分离过程中mRNA被污染的RNA酶降解b）增加了获得全长cDNA克隆的概率c）获得更准确的分级分离效果（分子量）3）多聚核糖体免疫学纯化法*使用抗体来纯化合成目的多肽的多聚核糖体。将正在合成的新生多肽链的多聚核糖体结合到免疫亲和柱（A蛋白-Sepharose柱）上，随后用EDTA将多聚核糖体解离下来，并通过Oligo(dT)层析分离mRNA,利用该方法可将目的mRNA纯化数千倍.目的mRNA在细胞中的含量可为数十拷贝.1.2第一链cDNA的合成oligo(dT)引导的DNA合成法：利用真核mRNA分子所具有的poly(A)尾巴的特性，加入12-20个脱氧胸腺嘧啶核苷组成的oligo(dT)短片段，由反转录酶合成cDNA的第一链。缺陷：因为逆转录酶无法到达mRNA分子的5’－末端，必须从3’－末端开始合成cDNA。对于大分子量的较长的mRNA分子而言，特别麻烦。随机引物引导的cDNA合成法(randomlyprimedcDNAsynthesis)：根据许多可能的序列，合成出6-10个核苷酸长的寡核苷酸短片段（混合物），作为合成第一链cDNA的引物。在应用这种混合引物的情况下，cDNA的合成可以从mRNA模板的许多位点同时发生，而不仅仅从3’-末端的oligo(dT)引物一处开始。1.3第二链cDNA的合成cDNA第二链的合成就是将上一步形成的mRNA-cDNA杂合双链变成互补双链cDNA的过程。cDNA第二链的合成的方法大致4种：自身引导合成法、置换合成法、引导合成法、引物－衔接头合成法。1）自身引导合成法：获得的单链cDNA3’端会形成发夹结构的能力，以此作为第二链合成的引物，在大肠杆菌聚合酶IKlenow或反转录酶的作用下，合成cDNA的第二链。缺点：在以S1核酸酶切割cDNA的发夹状结构时，会导致对应于mRNA5’端的地方的序列出现缺失和重排。S1核酸酶的纯度不够时，会偶尔破坏合成的双链cDNA分子。2）置换合成法：获得的双链cDNA5’端也会有几对碱基缺失原理：以第一链合成产物cDNA：mRNA杂交体作为切口平移的模板，RNA酶H在杂交体的mRNA链上造成切口和缺口，产生一系列RNA引物，在大肠杆菌DNA聚合酶I的作用下合成cDNA的第二链。优点：a）合成cDNA的效率高b）直接利用第一链的反应产物，不需纯化c）避免使用S1核酸酶来切割双链cDNA3）引导合成法：获得的双链cDNA能保留完整的5’端序列4）引物-衔接头法1.4双链cDNA克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖cDNA末端的处理由于大片段的平末端连接效率非常低，因此为了避免用平末端与载体连接，对双链cDNA的末端进行加工是十分必要的方法：添加特异性核酸接头以形成适合于克隆的黏性末端末端转移酶—可以向cDNA末端加上与克隆载体末端互补的尾部基因组DNA文库cDNA文库3基因组DNA文库与cDNA文库的比较3.1基因组DNA文库的优点相对于cDNA文库，基因组文库的优点：cDNA克隆只能反映着mRNA的分子结构，没有包括基因组的间隔序列，cDNA文库中，不同克隆的分布状态总是反映着mRNA的分布状态，即：高丰度mRNA的cDNA克隆，所占比例较高，分离基因容易；低丰度mRNA的cDNA克隆，所占比例较低，分离基因困难；从cDNA克隆中，不能克隆到基因组D