天然药物化学.-第二章--天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法和技术概要

第二章天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法和技术第一节提取方法与技术天然药物化学的研究是从有效成分或生理活性化合物的提取、分离工作开始的。在进行提取之前，应对所用的药材进行如下的考查：基源（学名）、产地、药用部位、采集时间与方法。还要系统查阅文献，以充分了解和利用前人的经验。（同一品种其含成分含量因产地、取材部位、采集时间、存放条件不同而有变化）已知成分或已知化学结构类型：一般先查阅有关资料,（工业生产中常用）搜集比较各种提取方法为制定研究工作方案提供依据。未知有效成分或有效部位：①根据预先确定的目标。（实验室常用）②以适当的活性测试体系为指导。③提取、分离、动物模型筛选。④临床验证。提取中草药有效成分的提取提取是研究天然产物的一个重要步骤，常用的方法有溶剂提取法、水蒸气蒸馏法和升华法。水蒸气蒸馏法：适用于有挥发性的能随水蒸气蒸馏而不被破坏且难溶或不溶于水的成分的提取。例如挥发油类成分。升华法：适用于具有升华性质的成分的提取。例如樟脑、咖啡因等溶剂提取法:选择适当溶剂将中草药中的化学成分从药材中提取出来。1.概念：根据天然药物中各种化学成分的溶解性能，选择对有效成分溶解度大而对其他成分溶解度小的溶剂，用适当方法将所需化学成分尽可能完全从药材组织中溶解提出的方法。溶剂的提取过程是溶剂对药材组织细胞不断作往返的扩散、渗透、溶解的过程，直至药材组织细胞内外溶液中被溶解的化学成分的浓度达平衡为止。一、溶剂提取法2.溶剂提取法的提取原理：根据化合物在极性相似的溶剂中有较好的溶解性即“相似者相溶”这一原理进行的。极性从低到高的顺序依次是：石油醚二硫化碳苯无水乙醚三氯甲烷乙酸乙酯正丁醇丙酮乙醇甲醇乙腈水吡啶3.溶剂的极性与介电常数ε有关，介电常数越大，极性越大化合物极性大小与分子结构直接相关，一般来说两种基本母核相同的成分，其分子中官能团的极性越大或极性基团数目越多，则整个分子的极性就越大表现亲水性越强，分子的非极性部分越大或碳链越长则极性越小，亲脂性越强。化合物的极性天然产物的极性大体可分为三类：极性（亲水性）、非极性（亲脂性）、中等极性（即亲水又亲脂）。亲脂性成分：萜类、甾体、脂环、芳香族成分，可选用氯仿、乙醚、石油醚等非极性溶剂。亲水性成分：糖苷、氨基酸等，可选用水、含水醇等极性溶剂。酸性、碱性及两性化合物：根据存在状态（游离型或解离型）。可选用不同PH值的溶剂。选择溶剂的原则：选择适当的溶剂是提取步骤的关键。主要根据溶剂的极性、被分离成分的性质、共存的其它成分（杂质）的性质三个方面。对于提取溶剂的要求：①对所提取成分的溶解度大，对杂质的溶解度小，或反之；②溶剂不能与所提取成分发生化学反应，若反应应当可逆；③要经济易得，具有一定的安全性；④沸点适中、便于回收和反复使用。⑴水亲水性成分。有时为了增加某些成分的溶解度，也常采用酸水及碱水作为提取溶剂。如：多数游离的生物碱是亲脂性化合物，不溶或难溶于水，但与酸结合成盐后，能够离子化，加强了极性，变为亲水性的物质，所以通常用酸水提取生物碱；对于有机酸、黄酮、蒽醌、内酯、香豆素以及酚类成分，常采用碱水提取，可使成分易于溶出。用水作溶剂提取存在一些问题：①易酶解苷类成分，且易霉坏变质；②对于含果胶、黏液质类成分较多的中草药，其水提取液常呈胶状，很难过滤；③含淀粉多的中草药，沸水煎煮时，淀粉可被糊化，过滤困难，所以不宜磨成细粉水煎；④含皂苷成分较多的中草药，水提液在减压浓缩时，常会产生大量泡沫，浓缩困难。⑵亲水性的有机溶剂能与水混溶的有机溶剂，如乙醇、甲醇、丙酮等。乙醇虽易燃，但毒性小，价格便宜，来源方便，有一定设备即可回收反复使用，且乙醇的提取液不易发霉变质。因此乙醇是实验室和工业生产中应用范围最广的一种溶剂。甲醇的性质虽和乙醇相似，但因为有毒性，所以少用。⑶亲脂性的有机溶剂与水不能互溶的有机溶剂，如石油醚、苯、氯仿、乙醚等。这些溶剂的选择性能强，不能或不容易提出亲水性杂质，易提取亲脂性的物质。这类溶剂易挥发，多易燃（氯仿除外），一般有毒，价格较贵，设备要求也较高，操作需要有通风设备；透入植物组织的能力较弱，往往需要长时间反复提取才能提取完全。药材中水分的存在，会降低这类溶剂的穿透力，很难浸出其有效成分，影响提取率，因此对原料的干燥程度要求较高。因此，在大量提取或工业生产时，直接应用这类溶剂有一定的局限性。4.提取前的预处理：•通常粉碎成粗粉；•种子类先脱脂；•水溶性成分的提取宜将药材切成小段、薄片或粗粉；•苷类要防止酶水解；•苷元及次生苷要保留酶的活性等等。5.影响提取因素：（1）药材的粉碎度药材粉碎得越细，中药粉末的表面积越大，提取效率高，但粉碎过细，则表面吸附作用也增强，反而影响扩散速度，降低了提取效率，另一方面，杂质的提取量也增高。一般情况下，用有机溶剂提取时，以过20目筛为宜。用水提取时，则用粗粉或薄片。溶剂提取法的关键是选择合适的溶剂和提取方法，但在操作过程中，还受其他因素的影响。（2）温度一般来讲，热提取效率高，但杂质多，冷提杂质少，效率低。加热温度不宜超过100℃。在50～60℃的条件下进行提取保持较好的提取率，又不使过多的杂质溶出。（3）时间和提取次数药材中有效成分随着提取时间的延长而出量增大，直到药材细胞内外有效成分浓度达到平衡为止。一般情况下，用水加热煮时以每次1～2小时为宜，进行2～3次。6.提取方法常用的提取法有浸渍法、渗漉法、煎煮法、回流提取法及连续回流提取法。(1)浸渍法此法适用于有效成分遇热易挥发和易破坏的中草药的提取。按溶剂的温度分为热浸、温浸、冷浸等。操作：现将中草药粉或碎片装入适当的容器中，然后加入适宜的溶剂，浸渍药材以溶出其中有效成分。特点：简单易行，但提出率较低。最好采用二次、三次浸渍，以减少损失，提高提取率。如果溶剂为水的话，需加入适当的防腐剂。(2)渗漉法操作：将中草药粉末装在渗漉器中使药材浸渍24~48小时膨胀，然后不断添加新溶剂，使其自上而下渗过药粉，从渗漉筒下端出口流出、收集浸出液。当溶剂渗进药粉溶出成分比重加大而向下移动时，上层的溶液或稀浸液便置换其位置，造成良好的浓度差，使扩散能较好地进行，故浸出效率较高，当浸出液很浅时提取基本完全。但溶剂消耗量大、费时长。渗漉装置(3)煎煮法操作：将中药粗粉加水加热（加热时最好时常搅拌，以免局部药材受热容易焦糊）煮沸，将中药成分提取出来。一般药材易煎2次。所用容器一般为陶器、砂罐或铜制、搪瓷器皿，不宜用铁锅，以免药液变色。特点：此法简便，能煎出大部分有效成分，但煎出液中杂质较多，且容易发生霉变，一些不耐热挥发性成分易损失。因此含挥发性成分及有效成分遇热易破坏的中药不宜用此法，对含有多糖类中药，煎煮后，药液比较粘稠，过滤比较困难。(4)回流提取法如用易挥发的有机溶剂加热提取中药成分时，则需采用回流提取法以减少溶剂消耗，提高浸出效率。但受热易破坏的成分不宜用此法，且溶剂消耗量仍大，操作亦麻烦。此法提取效率较冷浸法高，但是由于操作的局限性，大量生产中多采用连续提取法。（5）连续提取法：为了弥补回流提取法中需要溶剂量大、操作较烦的不足，可采用连续提取法。实验室常用索氏提取器。此法需要溶剂量较少，提取成分也比较完全，但一般需数小时（提取液受热时间长）才能完成，因此对热不稳定易变化的成分不宜用此法。尽管如此，在应用挥发性有机溶剂提取时，不论小型实验或大型生产均以连续提取法为好。索氏提取器(6)超声提取技术利用超声波的空化作用，破坏植物药材的细胞，使溶剂易于渗入细胞内，同时超声波的强烈震动能传递巨大能量给浸提的药材和溶剂，使他们做高速运动，加强了胞内物质的释放、扩散和溶解，加速有效成分的浸出，极大地提高提取效率。超声波在传递过程中形成许多小空穴，这些小空穴瞬间闭合，可形成几千个大气压的压力，同时局部温度可达到千度以上，这种现象叫做空化•无需高温。适用于热不稳定。•常压提取，安全性好，操作简单易行，维护保养方便。•提取效率高。•适用性广，绝大多数的中药材各类成份均可超声提取。•提取工艺成本低，综合经济效益显著。特点操作将药材粉末置适宜容器内，加入定量溶剂，密闭后置于超声波提取器，选择适当超声频率提取一段时间。（一）水蒸气蒸馏法：是将含有挥发性成分的药材与水共蒸馏，使挥发性成分随水蒸气一并馏出，经冷凝分取挥发性成分的浸提方法。当馏出液由浑浊变为澄清时，表示蒸馏已基本完成。该法适用于具有挥发性、难容或不溶于水、与水不会发生反应、能随水蒸气蒸馏而不被破坏的中草药成分的提取。如，麻黄碱就可以用此法直接从麻黄中蒸馏出来，这个方法主要用于挥发油二、其他提取方法(二)升华法有些固体物质受热后会直接汽化，遇冷后又凝固为原来的固体化合物，该现象称之为升华。对于具有升华性质的有效成分，可采用升华法提取。如从樟木中提取樟脑，从茶叶中提取咖啡碱。此法简单易行，但在实际提取时很少采用。因为升华所需温度很高，中草药容易炭化，炭化后产生的挥发性的焦油状物，容易黏附在升华物上，不易精制除去；其次，升华不完全，产率低，有时还伴随有分解现象。超临界流体：一物质处于临界温度（Tc）与临界压力（Pc）以上的状态下，形成的既非液体又非气体的单一相态时，称为超临界流体。特点：流体密度近似液体，粘度于气体相似，扩散力比液体大，介电常数随压力增大而增加，渗透性优于液体。比液体溶剂有更佳的溶解力，有利于溶质的萃取。（三）超临界流体萃取技术二氧化碳的优点：1）不残留有机溶剂、萃取速度快、收率高，安全不易燃烧及化学性质稳定。2）萃取温度较低，适用于对热不稳定物质的提取。3）萃取介质的溶解特性容易改变，一定温度下改变压力。4）可以加入夹带剂，改变介质极性。5）适于对极性较大和分子量较大物质的萃取。6）萃取介质可循环利用，无毒，成本低。常用作超临界流体的物质：二氧化碳、氧化亚氮、乙烷、乙烯和甲苯等超临界萃取的局限性：1）对脂溶性成分溶解能力强，对水溶性成分溶解能力弱。2）设备造价高，设备折旧费比例大。3）更换产品时清洗设备较困难。提取天然药物得到的提取液是混合物，需要进行进一步的分离与精制。去其糟粕，取其精华。1.溶解度的差异：如结晶法、沉淀法等2.分配比不同：如萃取法3.吸附性差异：物理吸附、化学吸附及半化学吸附4.分子大小差异：透析法、凝胶滤过法、超滤法5.离解程度不同：离子交换法或电泳分离依据：共存成分的性质差异第二节分离精制和鉴定的方法与技术1.系统溶剂提取法：是研究天然药物成分的初步提取分离方法。用极性从低到高的溶剂依次提取。石油醚→油脂、蜡、叶绿素、挥发油、游离甾体及三萜类氯仿或醋酸乙酯→游离生物碱、有机酸及黄酮、香豆素的苷元丙酮或乙醇、甲醇→苷类、生物碱盐、鞣质等水→氨基酸、糖类、无机盐等本法的缺点：由于各成分之间的助溶作用，同一类成分往往也会分散在邻近的几个部位中。但系统溶剂法仍是研究成分不明的天然药物最常用的方法。一、根据物质溶解度的差异进行分离2.结晶与重结晶法结晶和重结晶是利用固体混合物中各种成分在溶剂中的溶解度的差别，使所需成分以结晶状态析出，达到分离精制的目的。结晶溶剂的选择：（1）不与结晶物质发生化学反应；（2）对结晶物质的溶解度随温度不同有显著差异，热时溶解度大，冷时溶解度小；对可能存在的杂质溶解度非常大或非常小；（3）沸点适中，不宜过高或过低。常用溶剂有水、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、三氯甲烷等。还可用两种或两种以上的混合溶剂操作：在将被提取物晶体置于单口瓶中，加入较需要量稍少的适宜溶剂，加热到微微沸腾一段时间后，若未完全溶解，可再添加溶剂，每次加溶剂后需再加热使溶液沸腾，直至被提取物晶体完全溶解（但应注意，在补加溶剂后，发现未溶解固体不减少，应考虑是不溶性杂质，此时就不要再补加溶剂，以免溶剂过量）。温度不同——溶解度差异结晶、重结晶待纯化物A+杂质B、C加MeOH热溶热滤残渣（C）滤液（A+B）冷置析晶母液（B）结晶（A）3.沉淀法：在溶液中加入某些试剂或溶剂，使部分物质沉淀析出，达到分离的目的。解离型/离子态游离型/分子态H+BH+BOH-H+A-HAOH-脂溶性水溶性（1）酸碱沉淀法通过加入酸、碱以调