铜绿假单胞菌

假单胞菌属1.革兰氏阴性2.细胞单个3.直的或弯的杆菌4.0.5—1×1.5—4微米5.单鞭毛或多鞭毛6.有机化能异养菌7.呼吸代谢，永不发酵8.严格好氧菌模式种：铜绿假单胞菌•1.0.5-0.8*1.5-3.0微米的杆菌•2.细胞单个•3.成对或成短链。以极生的单鞭毛运动（有二个或二个以上的极生鞭毛的细胞，但不常见）•4.在中性或碱性培养基种呈蓝色：在酸性培养基种呈红色•5.专性好氧，在硝酸盐培养基中除外。•6.最适温度约37℃。41℃生长而4℃不生长。•7.能从土壤和水中分离到•8.侵袭性弱，一般认为属条件致病菌铜绿假单胞菌菌落特征1.正常人皮肤，尤其潮湿部位如腋下、会阴部及耳道内，呼吸道和肠道均有该菌存在，但分离率较低。2.医源性感染3.术后操作感染（气管切开、保留导尿管等）4.人、病人与病人的接触也为传播途径之一感染途径：当机体免疫功能受损或缺损时，可引起严重的甚至致死性的感染。检查意义：•人及动物的皮肤、肠道、上呼吸道等处都有该菌存在。绿脓杆菌抵抗力较强，湿热55℃1小时才被杀死。•对紫外线不敏感。对多种抗生素易产生耐药性。本菌仅于人体防御功能改变或直接进入机体（如通过泌尿道插管及静脉导管、呼吸道的通气设备和其他治疗检查方法）以及混合感染时才具有致病性。•长期使用抗生素、肾上腺皮质激素、免疫抑制剂或大面积烧伤、肾功能不全、心脏病、慢性支气管肺疾患的患者易继发绿脓杆菌的感染。•绿脓杆菌是医院内感染的重要病原菌之一。•胨20.0g磷酸二氢钾1.3g•乳糖5.0g牛胆盐2.0g•氯化钠5.0g(或去氧胆酸钠）（0.5g)•磷酸氢二钾4.0g水1000ml•除乳糖、牛胆盐或去氧胆酸钠外，取上述成分，混合，微温溶解，调节PH值使灭菌后为7.4±0.2，煮沸，滤清，加入乳糖、牛胆盐或去氧胆酸钠，分装，灭菌。培养基成分：牛胆盐为抑菌剂，用于抑制一些杂菌的生长。出处：《中国人民共和国药典》2010版二部附录XIJ微生物限度检查法P114胆盐乳糖培养基（BL）培养基成分：•溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基•胨10g•溴化十六烷基三甲铵0.3g•牛肉浸出粉3g•琼脂15~20g•氯化钠5g•水1000ml•除琼脂外，取上述成分，混合，微温使溶解，调节pH值使灭菌后为7.5±0.1，加入琼脂，加热溶化后，分装，灭菌，冷至60℃，倾注平皿。•溴化十六烷基三甲铵——具有优良的渗透、柔化、乳化、抗静电、生物降解性及杀菌等性能。本产品化学稳定性好，耐热、耐光、耐压、耐强酸强碱。•溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基是铜绿假单胞菌的选择性培养基，也是美国药典和中国药典等国推荐使用于食品、药品中铜绿假单胞菌检测的培养基。书本P1615.14培养基成分：营养琼脂培养基•胨10g•牛肉浸出粉3g•氯化钠5g•琼脂15~20g•水1000ml•（以营养肉汤培养基的处方及制法）取上述成分，混合，煮沸溶解后，调节pH值使灭菌后为7.2±0.2，分装，灭菌。书本P1595.2绿脓菌素培养基成分：PDP斜面，是否有色素，有，用氯仿3-5ml萃取，用无菌玻璃棒搅碎培养基、混匀，色素完全在氯仿层。吸管把氯仿层移到另一试管，加入盐酸1M1ml，静置后，盐酸出现粉红为阳性，无粉红为阴性，阴性斜面培养1-2天再重新做一遍。如果仍是阴性。做下一步试验。绿脓菌素从有机相转到酸性水相中会由蓝绿色变为粉红色。•绿脓菌素(pyocyanin)测定用培养基(PDP琼脂)•胨20g•甘油10ml•氯化镁(无水)1.4g•琼脂18~20g•硫酸钾10g•水1000ml•取胨、氯化镁和硫酸钾加入水中，微温使溶解，调节pH值使灭菌后为7.3±0.1，加入甘油及琼脂，加热溶化，混匀，分装于试管，灭菌，置成斜面。•书本P1635.26样品10gBLBL供试液缓冲液100ml阴性10ml10ml培养温度：36℃培养时间：18~24h（必要时可延长至48h）增菌培养十六烷基三甲基溴化铵平板十六烷基三甲基溴化铵平板营养琼脂斜面BL阳性供试品供试液胆盐乳糖增菌液十六烷基三甲基溴化铵平板36±1℃18~24h营养琼脂斜面36±1℃24h氧化酶试验革兰氏染色镜检阴性报告36±1℃24h氧化酶试验阴性阳性报告绿脓菌素试验阳性阴性报告42℃生长试验硝酸盐还原试验明胶液化试验报告生物学特性•非发酵革兰氏阴性杆菌•常见的条件致病菌•菌体的一端有单鞭毛•在暗视野显微镜或相差显微镜下观察可见细菌运动活泼。•本菌为专性需氧菌，生长温度范围25~42℃，最适生长温度为25~30℃，特别是该菌在4℃不生长而在42℃可以生长的特点可用以鉴别。在普通培养基上可以生存并能产生水溶性的色素，如绿脓素（pyocynin）与带荧光的水溶性荧光素（pyoverdin）等。在血平板上会有透明溶血环。•该菌含有O抗原（菌体抗原）以及H抗原（鞭毛抗原）。O抗原包含两种成分：一种是其外膜蛋白，为保护性抗原；另一种是脂多糖，有特异性。O抗原可用以分型。铜绿假单胞菌•形态：G-b菌体长短不一球杆状或长丝状单端单鞭毛动力+无芽胞•特性：专性需氧营养要求不高35℃+4℃－42℃+可形成多种不同形态的菌落产多种色素(主要为绿脓素、荧光素)实验室检查及其它检查•标本采集•采自不同感染部位的各种标本，包括血液、尿液、痰标本、脓汁、穿刺液等。还包括来自医院环境中的各种标本如水、空气、物体表面采样等。•染色镜检•为革兰阴性菌，菌体大小（1.5～5.0)um×宽(0.5～1)um，细长且长短不一，有时呈球杆状或线状，成对或短链状排列。菌体的一端有单鞭毛，无芽胞。发酵型氧化型产碱型分离培养•本菌生长对营养要求不高。对有正常菌群存在的临床标本或采自环境中的标本应接种选择性培养基如麦康凯琼脂培养基（MAC）；对无正常菌群存在的临床标本如血液、脑脊液、穿刺液等可接种普通或血琼脂培养基。•在普通琼脂培养基上生长18~24h可以见到扁平、湿润的菌落，该菌所产生的带荧光的水溶性青脓素与绿脓素相结合将使得培养基呈亮绿色；在血琼脂平板上生长时可以见到在菌落的周围有溶血环，菌落呈金属光泽；如果是在液体培养基中则呈浑浊状生长，在液体表面形成菌落，而在培养基底部细菌的生长不良。假单胞菌属Pseudomonas种类：•铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)•荧光假单胞菌(P.fluorescence)•恶臭假单胞菌(P.putica)•斯氏假单胞菌(P.stutizeri)•曼多辛假单胞菌(P.mendocina)•产碱假单胞菌(P.alcaligenes)•假产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)嗜麦芽15%其他13%不动杆菌16%铜绿假单胞菌56%非发酵菌分离率假单胞菌属Pseudomonas•共同特点：G-b菌体细长单端鞭毛无芽胞专性需O2营养要求不高35℃生长，少数4℃、42℃生长葡萄糖O/－动力+氧化酶+可产多种色素：绿脓素荧光素脓玉红素各种菌产生的色素菌名色素颜色铜绿假单胞菌绿脓素、红脓素、青脓素、荧光素蓝、红、黑、黄色荧光假单胞菌荧光素黄绿色恶臭假单胞菌荧光素黄绿色斯氏假单胞菌未定名黄色素黄色洋葱伯克霍尔德菌未定名黄色素、紫色素黄色、紫色腐败希瓦讷拉菌未定名色素淡红褐色各种标本血平板和Mac平板可疑菌落涂片革兰染色革兰阴性杆菌氧化酶(+)、OF：O非发酵菌鉴定系统鉴定到种微生物检验程序•生化反应：氧化酶+OF：O硝还+N2+液化明胶+枸橼酸盐+精双水解+乙酰胺酶+吲哚-电镜图铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌•抗原：O抗原(外膜蛋白-保护性抗原脂多糖-型特异性)H抗原血清学分型•抵抗力：抵抗力强耐干燥不耐热多重耐药在室温水中长期生存4℃不生长致病性•广泛存在环境中的条件致病菌，是院内感染主要病原菌•可引起皮肤感染、呼吸道感染、泌尿道感染、烧伤感染、囊性纤维变性等•有多种毒力因子：包括菌毛、荚膜多糖、内毒素、外毒素、绿脓菌素、蛋白酶、磷脂酶等铜绿假单胞菌•粘附素：菌毛的神经氨酸酶分解上皮细胞表面的神经氨酸促进细菌侵入•荚膜：多糖类物质抗吞噬细胞的吞噬作用；使细菌锚泊在细胞表面，与呼吸道感染有关•内毒素、外毒素•绿脓菌素：绿色色素，由铜绿假单胞菌的RpoS基因编码产生的代谢产物，具有氧化还原活性的化合物，能催化超氧化物和过氧化氢产生有毒氧基团，引起组织损伤。在致病中起重要作用•弹性蛋白酶：降解弹性蛋白，引起肺实质损伤和出血；降解补体和白细胞蛋白酶抑制物；可与相应抗体形成复合物，沉积于感染组织中•磷脂酶C微生物检验•采集标本：各种临床标本医疗器械环境用品•检验方法：直接镜检分离培养(血平、MAC平板)鉴定分型：血清学分型、质粒指纹图谱分型、脉冲场凝胶电泳分型等分离培养•普平：18-24h圆形大小不一边缘不整扁平湿润常呈融合态琼脂被染成绿或黄绿•血平：扁平湿润有金属光泽琼脂被染成蓝绿或灰绿有溶血环•MACc平：微小无光泽半透明48h后菌落呈棕色鉴定•初步鉴定菌体形态菌落特征产色素气味氧化酶•最终鉴定非发酵菌生化鉴定系统API-NE试条•细菌耐药机制–外膜通透性降低–产生灭活酶或钝化酶–主动外排系统将抗生素泵出胞外–抗菌药物作用靶位改变–膜孔蛋白突变–生物膜屏障作用•各种抗生素治疗铜绿假单胞菌所致感染过程中都可能发生耐药。初代敏感菌株在治疗3－4天后可能发生耐药，有必要重复分离菌株•本菌对多种抗生素天然耐药，常用三代头孢和氨基糖苷类联合治疗鉴定结果分析•从临床标本中分离出来的铜绿假单胞菌，需要排除污染因素•铜绿假单胞菌下呼吸道感染需连续三次痰培养阳性才能确立。典型型大肠菌样型粘液型侏儒型粗糙型铜绿的菌落分型粘液型（麦康凯平板）粘液型（血平板）菌落光滑凸起成粘液状侏儒型（麦康凯平板）细小，无光泽半透明菌落典型型（麦康凯平板）菌落呈灰绿色大小不一扁平湿润边缘不规则呈伞状伸展表面常可见金属光泽典型型（普通平板上）产绿脓素琼脂染成黄绿色粗糙型（麦康凯平板）菌落中央凸起边缘扁平表面粗糙大肠型（麦康凯平板）菌落圆形凸起似大肠埃希菌菌落常见非发酵菌初步分群鉴定试验假单胞不动杆产碱杆黄杆莫拉菌属菌属菌属菌属菌属氧化酶+-+++葡萄糖O/FO/-O/--O/F-动力+-+--MAC平板生长++++/--