TAIL-PCR-原理

TAIL-PCR定义：热不对称交错PCR(ThermalAsymmetricInterlacedPCR,简称TAIL-PCR)是一种用来分离与已知序列邻近的未知DNA序列的分子生物学技术。基本原理：利用目标序列旁的已知序列设计3个嵌套的特异性引物(specialprimer,简称sp1,sp2,sp3),用它们分别和1个具有低Tm值的短的随机简并引物(Arbitrarydegenerateprime简称AD)相组合,以基因组DNA作为模板,通过3轮具热不对称的温度循环的分级反应来进行PCR扩增，从而获得已知序列旁的侧翼序列。由一个特异性引物和一个简并引物相组合构成的PCR反应叫做“半特异性PCR”。这种反应会产生3种不同类型的产物:(1)由特异性引物和简并引物扩增出的产物;(2)由同一特异性引物扩增出的产物;(3)由同一简并引物扩增出的产物。在TAIL-PCR反应中,后两种非目标产物可以通过以嵌套的特异性引物进行的后续反应来消除。knownseqUnknownseqSP1SP2SP3AD第1轮特异性产物第3轮特异性产物第2轮特异性产物第一轮模板为基因组DNA，引物SP1+AD第二轮模板将第一轮产物稀释约500-1000倍作为模板，引物SP2+AD第三轮模板将第二轮产物稀释约500-1000倍作为模板，引物SP3+ADTAIL-PCR操作流程：1、基因组DNA的获取：可用CTAB/SDS提取真菌或植物基因组DNA，用溶菌酶法提取细菌基因组DNA。以基因组DNA作为第一轮PCR反应的模板。2、已知序列的验证：在进行PCR实验之前必须对已知序列进行验证，以确认已知序列的正确性。具体方法为：根据已知序设计特异性引物（扩增长度最好不少于500bp），对模板进行PCR扩增，然后对PCR产物进行测序，再与参考序列比较确认已知序列的正确性。3.引物的设计：TAIL-PCR反应对引物的要求较高，3个嵌套的特异性引物长度一般在20~30bp之间，Tm值一般设58~68℃。SP1、SP2和SP3之间最好相距100bp以上以便在电泳时更容易区分3轮PCR产物.随机引物是按照物种普遍存在的蛋白质的保守氨基酸序列设计的，相对较短，长度一般是14bp左右，Tm值介于30~48℃之间。4.三轮PCR反应：第一轮PCR反应由5次高特异性反应、1次低特异性反应、10次较低特异性反应和12次热不对称的超级循环构成。通过5次高特异性的反应,使sp1与已知的序列(载体或T-DNA等)退火并延伸,目标序列扩增成直线性型上升；1次低特异性的反应使简并引物结合到较多的目标序列上,接下来10次较低特异性的反应使两种引物均能与模板退火,从而使原来由高严谨性循环所产生的单链靶DNA复制成双链DNA.最后是进行12次热不对称的TAIL循环(超级循环即高特异性和低特异性循环交替)，目的片段得以指数性地扩增。经过第一轮反应得到了不同浓度的3种类型的产物:特异性产物(Ⅰ型)和非特异性产物(Ⅱ型和Ⅲ型)。第一轮PCR反应第二轮反应则将第一轮反应的产物稀释1000倍作为模板,通过10次热不对称的超级循环,使特异性的产物被选择性地扩增,而非特异性的产物被压制到极低的含量。第二轮PCR反应第三轮反应又将第二轮反应的产物稀释1000倍作为模板,一般设置为普通的PCR反应或热不对称的超级循环。通过上述3轮PCR反应可获得与已知序列邻近的目标序列。第三轮PCR反应5.电泳检测。取第一，第二，第三轮PCR产物各3ul,用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测。6.测序验证。切胶回收清晰的电泳条带，以SP3为引物对PCR产物进行测序验证。操作注意事项：1.引物设计：特异引物长度为22-26nt,GC含量为45%-55%，Tm一般为58～68℃。再按照物种普遍存在的蛋白质的保守氨基酸序列设计一系列简并引物,简并引物相对较短,长度为14bp,Tm为30～48℃。特异引物与随机引物Tm值要求至少相差10度以上。特异性引物和简并引物的选择直接影响扩增的效果。如果不能获得满意的扩增结果,则应该在预备实验中重新设计特异性引物或者换用其它的简并引物。2.TAILPCR的引物浓度：为减少错配，特异引物应保持较低浓度；而简并引物的浓度要高，一般为2.5～5.0pmol/μL，以满足引物的结合效率。3.反应条件：在TAIL-PCR反应中，高特异性循环的退火温度设为65℃左右，较低特异性循环的退火温度设为44℃，低特异性循环的退火温度设为25-3O℃。在高严紧的循环中，退火温度要尽可能高，比特异引物的Tm要高1-5℃。可根据需要选择延伸时间，延伸时间长可以获取较长的DNA片段，但是容易产生非特异性PCR扩增。一般延伸时间为2min。TAIL-PCR技术有以下优点:(1)简单。只要设计好引物,即可以用基因组DNA作模板直接筛选到目标序列。节省了PCR反应前后的许多费时、费力的操作程序。只需几纳克的DNA即可作为模板,对其纯度的要求也不很高。(2)特异性高。用短的简并引物和长的特异性嵌套引物相组合,通过不对称的温度循环和分级反应,使反应体系有利于特异引物的扩增,最终的扩增产物中目的片段占绝对优势,反应产物可以直接用做探针标记和测序模板。(3)高效灵敏。使用任何一个AD引物,在60%～80%的反应中能够产生特异性产物。运用不同的AD引物就能够有效地扩增到目标片段。(4)快速。整个TAIL-PCR反应循环能够在1d内完成,可以快速地获得目标片段。(5)不涉及连接反应,反应产物准确可靠,重复性好。TAIL-PCR应用：该技术具有简单快速、特异性高、分离出的DNA序列可以用于图位克隆、遗传图谱绘制和直接测序.TAIL-PCR技术能够分离获得：YAC、BAC克隆插入片段末端序列基因的5'端侧翼序列基因的启动子序列T-DNA、转座子及反转座子插入侧翼序列