色谱分析法概论

1第一章色谱分析法概论第一节概述色谱分析法简称色谱法或层析法(chromatography)，是一种物理或物理化学分离分析方法。从本世纪初起，特别是在近50年中，由于气相色谱法、高效液相色谱法及薄层扫描法的飞速发展，而形成一门专门的科学——色谱学。色谱法已广泛应用于各个领域，成为多组分混合物的最重要的分析方法，在各学科中起着重要作用。历史上曾有两次诺贝尔化学奖是授予色谱研究工作者的：1948年瑞典科学家Tiselins因电泳和吸附分析的研究而获奖，1952年英国的Martin和Synge因发展了分配色谱而获奖；此外在1937～l972年期间有12次诺贝尔奖的研究中，色谱法都起了关键的作用。色谱法创始于20世纪初，1906年俄国植物学家Tsweet将碳酸钙放在竖立的玻璃管中，从顶端倒入植物色素的石油醚浸取液，并用石油醚冲洗。在管的不同部位形成色带，因而命名为色谱。管内填充物称为固定相(stationaryphase)，冲洗剂称为流动相(mobilephase)。随着其不断发展，色谱法不仅用于有色物质的分离，而且大量用于无色物质的分离。虽然“色”已失去原有意义，但色谱法名称仍沿用至今。30与40年代相继出现了薄层色谱法与纸色谱法。50年代气相色谱法兴起，把色谱法提高到分离与“在线”分析的新水平，奠定了现代色谱法的基础，l957年诞生了毛细管色谱分析法。60年代推出了气相色谱—质谱联用技术(GC-MS)，有效地弥补了色谱法定性特征差的弱点。70年代高效液相色谱法(HPLC)的崛起，为难挥发、热不稳定及高分子样品的分析提供了有力手段。扩大了色谱法的应用范围，把色谱法又推进到一个新的里程碑。80年代初出现了超临界流体色谱法(SFC)，兼有GC与HPLC的某些优点。80年代末飞速发展起来的高效毛细管电泳法(highperformancecapillaryelectrophoresis，HPCE)更令人瞩目，其柱效高，理论塔板数可达l07m-1。该法对于生物大分子的分离具有独特优点。色谱法的分离原理主要是利用物质在流动相与固定相之间的分配系数差异而实现分离。色谱法与光谱法的主要区别在于色谱法具有分离及分析两种功能，而光谱法不具备分离功能。色谱法是先将混合物中各组分分离，而后逐个分析，因此是分析混合物最有力的手段。这种方法还具有高灵敏度、高选择性、高效能、分析速度快及应用范围广等优点。色谱法可从不同的角度进行分类：21.按流动相与固定相的分子聚集状态分类在色谱法中流动相可以是气体、液体和超临界流体，这些方法相应称为气相色谱法(gaschromatography，GC)、液相色谱法(liquidchromatography，LC)和超临界流体色谱法(supercriticalfluidchromatography，SFC)等。按固定相为固体(如吸附剂)或液体，气相色谱法又可分为气-固色谱法(GSC)与气-液色谱法(GLC)；液相色谱法又可分为液-固色谱法(LSC)及液-液色谱法(LLC)。2.按操作形式分类可分为柱色谱法、平板色谱法、电泳法等类别。柱色谱法(columnchromatography)是将固定相装于柱管内构成色谱柱，色谱过程在色谱柱内进行。按色谱柱的粗细等，又可分为填充柱(packedcolumn)色谱法、毛细管柱(capillarycolumn)色谱法及微填充柱(microborepackedcolumn)色谱法等类别。气相色谱法、高效液相色谱法(highperformanceliquidchromatography，HPLC)及超临界流体色谱法等属于柱色谱法范围。平板色谱法(planar或planechromatography)是色谱过程在固定相构成的平面状层内进行的色谱法。又分为纸色谱法(paperchromatography；用滤纸作固定液的载体)、薄层色谱法(thinlayerchromatography，TLC，将固定相涂在玻璃板或铝箔板等板上)及薄膜色谱法(thinfilmchromatography；将高分子固定相制成薄膜)等，这些都属于液相色谱法范围。毛细管电泳法(capillaryelectrophoresis，CE)的分离过程在毛细管内进行，利用组分在电场作用下的迁移速度不同进行分离。3.按色谱过程的分离机制分类可分为分配色谱法(partitionchromatography)、吸附色谱法(adsorptionchromatography)、离子交换色谱法(ionexchangechromatography，IEC)、空间排阻色谱法(stericexclusionchromatography，SEC)及亲合色谱法(affinitychromatography)等类型。色谱法简单分类如下表:3色谱法气相色谱法填充柱色谱法毛细管色谱法（GC）GLCGSC液相色谱法（LC）平板色谱柱色谱法经典液相柱色谱法高效液相色谱法（HPLC）薄层色谱法（TLC）纸色谱法SECLSCLLCLLCSECLSCIECLLC高效毛细管电泳法（HPCE）超临界流体色谱法（SFC）第二节色谱法的基本原理一、色谱过程色谱过程是物质分子在相对运动的两相间分配“平衡”的过程。混合物中，若两个组分的分配系数(distributioncoefficient)不等，则被流动相携带移动的速度不等—差速迁移，而被分离。吸附柱色谱法的操作及色谱过程如图18-l所示。把含有A、B两组分的样品加到色谱柱的顶端，A、B均被吸附到固定相上。然后用适当的流动相冲洗，当流动相流过时，已被吸附在固定相上的两种组分又溶解于流动相中而被解吸，并随着流动相向前移行，已解吸的组分遇到新的吸附剂颗粒，又再次被吸附，如此在色谱柱上不断地发生吸附、解吸、再吸附、再解吸……的过程。若两种组分的理化性质存在着微小的差异，则在吸附剂表面的吸附能力也存在微小的差异，经过反复多次的重复，使微小的差异积累起来就变成了大的差异，其结果就使吸附能力弱的B先从色谱柱中流出，吸附能力强的A后流出色谱柱，从而使各组分得到分离。4二、基本类型色谱法的分离机制1.分配色谱法分配色谱法利用被分离组分在固定相或流动相中的溶解度差别而实现分离。其固定相为液体，GLC和LLC都属于分配色谱法范围。分配色谱法的示意图如图18-2。图中X代表样品中某组分(溶质)分子，下标m与s分别为流动相与固定相。溶于流动相与溶于固定相的溶质分子处于动态平衡，平衡时浓度之比(严格应为活度比)为狭义分配系数(partitioncoefficient):mmssmsVXVXCCK//(1.1)溶质分子在固定相中溶解度越大，或在流动相中溶解度越小，则K越大。在LLC中K主要与流动相的性质(种类与极性)有关，在GLC中K与固定相极性和柱温有关。2.吸附色谱法吸附色谱法利用被分离组分对固体表面活性吸附中心吸附能力的差别而实现分离。其固定相为固体吸附剂，大部分GSC和LSC都属于吸附色谱法。吸附过程是样品中各组分的分子(X)与流动相分子(Y)争夺吸附剂表面活性中心(即为竞争吸附)的过程(图18-3)。吸附平衡可以表示为:maamnYXnYX流动相中组分的分子Xm与吸附在吸附剂表面的n个流动相分子Ya相置换，组分的分子被吸附，以Xa表示。流动相分子回至流动相内部，以Ym表示。吸附平衡常数称为吸附系数(Ka)，可近似用浓度商表示：namnmaaYXYXK5因为流动相的量很大，nanmYY/近似于常数，且吸附只发生于吸附剂表面，所以，吸附系数可写成：mmaamaaVXSXXXK////(1.2)式中Sa为吸附剂的表面积，Vm为流动相（展开剂）的体积。吸附系数与吸附剂的活性、组分的性质和流动相的性质有关。3.离子交换色谱法离子交换色谱法利用被分离组分离子交换能力的差别而实现分离。其固定相为离子交换树脂，按可交换离子的电荷符号又可分为阳离子交换树脂和阴离子交换树脂。以阳离子交换色谱为例说明分离机制。图1-4中R为树脂骨架，树脂表面的负离子(如SO3-)为不可交换离子；其正离子为可交换离子(H+离子)。当流动相中携带有正离子出现时，发生交换反应(见第2章)。交换反应达平衡时，以浓度表示的平衡常数称为选择系数(selec-tivitycoefficient；Ks)，即XRXKs/(1.3)式中RX+为交换到树脂上的阳离子，X+为在流动相中的游离阳离子。Ks与离子的电荷和水合离子半径、流动相性质和pH、离子交换树脂的性质及温度有关。4.空间排阻色谱法空间排阻色谱法根据被分离组分分子的线团尺寸而进行分离。其固定相是多孔性填料凝胶，故此法又称为凝胶色谱法(gelchromatography)，也称为分子排阻色谱法。该色谱法按流动相的不同分为两类：以有机溶剂为流动相者称为凝胶渗透色谱法(gel6permeationchromatography，GPC)；以水溶液为流动相者为凝胶过滤色谱法(gelfiltrationchromatography，GFC)。凝胶色谱法的分离机制与前三种色谱法完全不同，它只取决于凝胶的孔径大小与被分离组分线团尺寸之间的关系，与流动相的性质无关。其作用类似于分子筛的作用(反筛子)，示意图如图1-5。凝胶色谱法的分离机制有多种说法，空间排斥理论是目前被多数人所接受的理论。该理论有两条假设：(l)孔内外同等大小的溶质分子处于扩散平衡状态:XmXsXm与Xs分别代表在流动相与凝胶孔隙中同等大小的溶质分子。平衡时，两者浓度之比为渗透系数(permeationcoefficient；Kp)mspXXK/(1.4)(2)渗透系数的大小只由溶质分子的线团尺寸及凝胶孔隙的大小所决定。在凝胶孔径一定时：①当分子大到不能进入凝胶的所有孔隙时，[Xm]=0，则Kp=0；②当分子小到能进入所有孔隙时，[Xs]=[Xm]，Kp=1；③分子尺寸在上述两种分子之间时，0Kp1在高分子溶液中，相同成分的分子的线团尺寸与其分子量成比例。因此，在一定分予线团尺寸范围内，Kp与分子量相关。以上是四种基本类型的色谱法，这四类色谱法都可用于液相色谱法，而气相色谱法主要用前两类。此外，还有其他分离机制的色谱法。近年来最常见的一种色谱法是化学键合相色谱法(chemicallybonded-phasechromatography)，从分离机制讲，键合相色谱法并未超出上述基本类型，但是对于特定固定相在特定实验条件下，哪一种机制起主要作用仍是当前研究较多的问题。三、分配系数与保留行为的关系l.分配系数:达到分配“平衡”后，组分在固定相(s)与流动相（m）中的浓度（C）之比为分配系数(K)。K与组分、固定相和流动相的性质及温度有关。msCCK(1.5)72.保留时间:由进样到某组分色谱峰峰顶的时间间隔为该组分的保留时间(tR)，如图18-1所示。不保留(不溶于固定相或不被固定相所吸附等)组分的保留时间为死时间(t0)，亦即流动相的保留时间。保留时间是色谱法的基本定性参数，主要用于定距洗脱(定距展开)。所谓定距洗脱，即记录组分通过一定长度的色谱柱或色谱板的时间，如GC、HPLC及旋转薄层色谱法应用这种洗脱方式。记录组分在同一展开时间的迁移距离，称为定时洗脱(定时展开)。这种展开方式多用于薄层色谱法。3.保留时间与分配系数的关系:设在单位时间内一个分子在流动相中出现的几率(即在流动相中停留的时间分数)为R′，若R′=l/3，则这个分子l/3时间在流动相中，2/3时间在固定相中。对于大量分子，则可表示有l/3的溶质分子在流动相，而2/3(即l一R′)的溶质分子在固定相。因为在流动相及固定相中溶质的量可分别用CmVm及CsVs表示，所以，msmmssVVKVCVCRR1Vs与Vm分别为在色谱柱或薄层板中固定相与流动相所占体积，整理上式得:msVVKR11由于R表示溶质分子在流动相中的几率，而溶质分子只有出现在流动相中时才能随着流动相移动，因此若R=l/3，则表示它在色谱柱中的移动速度