方法验证

分析方法验证季向飞涉及以下问题：哪些检验项目需要方法验证？方法验证内容有哪些？如何进行验证？什么时候需要方法确认？什么时候需要再验证？验证文件怎样保存？2010版GMP正文：第十二条质量控制的基本要求：（四）检验方法应经过验证或确认；第二百二十三条检验应有物料和不同生产阶段产品的书面检验操作规程，阐述所用方法、仪器和设备。检验结果应有记录。1.企业应确保药品按照注册批准的方法进行全项检验。2.符合下列情形之一的，应对检验方法进行验证：(1)采用新的检验方法；(2)检验方法需变更的；(3)采用《中华人民共和国药典》及其它法定标准未收载的检验方法；(4)法规规定的其它需要验证的检验方法。3.对不需要进行验证的检验方法，企业应对检验方法进行确认，以确保检验数据准确、可靠。下表中列出了国内外针对分析方法验证的相关指南：机构或组织文件名称美国药典(USP)1225VALIDATIONOFCOMPENDIALPROCEDURES方法验证1226VERIFICATIONOFCOMPENDIALPROCEDURES方法确认人用药品注册技术要求国际协调会（ICH）ValidationOfAnalyticalProcedures:TextAndMethodologyQ2(R1)分析方法验证：文本以及方法Q2(R1)中国药典(Ch.P2010)附录XIXA药品质量标准分析方法验证指导原则11.1分析方法分析方法是为完成检验项目而设定和建立的测试方法，它详细描述了完成分析检验的每一步骤。一般包括分析方法原理、仪器及仪器参数、试剂、供试品溶液与对照品溶液的制备，测定，计算公式及检测限度等。分析方法可采用化学分析方法和仪器分析方法。这些分析方法各有特点，同一分析方法可用于不同的检验项目，但验证内容会有不同。例如采用高效液相色谱法用于药品的鉴别和杂质定量检验应进行不同要求的方法验证。前者重点要求验证专属性，而后者则需要重点验证专属性、准确度和定量限。方法验证在建立药品质量标准时，分析方法需经验证。定义：方法验证就是根据检验项目的要求，预先设置一定的验证内容，并通过设计合理的实验来验证所采用的分析方法是否符合检验项目的要求。目的：证明采用的分析方法科学、合理，符合检验要求并能有效控制药品的内在质量。作用：方法验证在分析方法建立过程中具有重要的作用。只有经过验证的分析方法才可以可靠有效地用于控制药品质量，因此方法验证是制订质量标准的基础。11.3方法确认在应用已验证的药典方法和其他法定方法前，应在当前的实验室条件下进行方法确认来证明方法在该实验室的适用性。11.4适用范围适用于：化学药品的物料，中间产品，中间过程控制和产品的理化分析方法的验证和确认.清洁验证方法的验证不适用于：化学药品的微生物方法（微生物方法的验证参见第17章）生物制品分析方法验证11.5方法验证的一般原则通常情况下，分析方法需进行方法验证。外观、崩解时限、密度、重量、pH值、硫酸盐、灰分、装量不需进行方法验证。方法验证的内容应根据检验项目的要求，结合所采用分析方法的特点确定。同一分析方法用于不同的检验项目会有不同的验证要求。11.6需要验证的检验项目检验项目是为控制药品质量，保证药品安全有效而设定的测试项目。根据检验项目的设定目的和验证内容的不同要求，本指导原则将需验证的检验项目分为四类：鉴别试验杂质的限度检查杂质的定量测定含量测定，包括原料药或制剂中有效成分的含量，制剂中其他成分（如防腐剂等）的含量，溶出度与释放度等检查中的溶出量、和含量均匀度。除此之外还有一些物理项目的检测如粒径分布、旋光度、熔点和硬度，其要求与其它检验项目有所不同，通常在进行分析方法验证应有不同的要求。鉴别的目的在于判定被分析物是目标化合物，而非其它物质。用于鉴别的分析方法要求具有较强的专属性和耐用性。杂质检查主要用于控制主成分以外的杂质，如无机杂质，有机杂质等。杂质检查分为限度检查和定量测定两部分。用于限度检查的分析方法验证侧重专属性、检测限和耐用性。用于定量测定的分析方法验证强调专属性、准确度、精密度、线性、范围、定量限和耐用性。含量测定对准确度要求较高，因此所采用的分析方法要求具有一定的专属性、准确度和线性等要求。中国药典2010版中规定了不同的检验项目需要验证不同的内容，详见表1。11.7方法验证内容本章节内容除特殊标注外，主要依据中国药典2010附录XIXA药品质量标准分析方法验证指导原则。11.7.1准确度准确度系指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度。一般用回收率表示。准确度应在规定的范围内测试。A.验证方法准确度应在规定的范围内建立，至少用9个测定结果进行评价。例如，设计3个不同浓度，每个浓度各分别制备3份供试品溶液，进行测定。应报告已知加入量的回收率（％）或测定结果平均值与真实值之差及其相对标准偏差或可信限。准确度是定量测定的必要条件，因此含量测定、杂质定量测定均需验证准确度。原料药与制剂所用的具体方法详见下表。例如：测定含量的准确度,按标示量的80%,100%和120%配制三个浓度的溶液，每个浓度各分别制备3份供试品溶液，进行测定。根据测定结果与配制浓度计算出平均回收率以及相对标准偏差。B.数据要求需报告已知加入量的回收率（％），或测定结果平均值与真实值之差及其相对标准偏差或可信限。11.7.2精密度精密度系指在规定的测试条件下，同一均匀供试品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度。精密度一般用偏差、标准偏差或相对标准偏差表示。精密度与准确度不同，下图形象地描绘了精密度和准确度之间的差别（A=准确度，P=精密度）。精密度测定了一系列重复性的被分析物之间的接近程度，但它不能表达与已建立的真值之间的符合程度，后者由准确度来测定。通过一系列的测定值，可以得到良好的精密度，但是由于所用分析方法存在的偏差，所得的平均值不一定与真实值（请看图中左下角的较低的打靶环数）相符，在这种状况下，需要修改方法以消除偏差。精密度可从重复性、中间精密度、重现性三个层次考察。详见下表重复性定义:在相同条件下，由同一个分析人员测定所得结果的精密度称为重复性。验证方法:在规定范围内，至少用9次测定结果进行评价。例如，设计3个不同浓度，每个浓度各分别制备3份供试品溶液，进行测定3次，或将相当于100％的浓度水平的供试品溶液，用至少测定6次的结果进行评价。中间精密度定义:在同一个实验室，不同时间由不同分析人员用不同设备测定结果之间的精密度，称为中间精密度。验证方法:为考察随机变动因素对精密度的影响，应设计方案进行中间精密度试验。变动因素为不同日期、不同分析人员、不同设备。重现性定义:在不同实验室之间由不同分析人员测定结果之间的精密度，称为重现性。验证方法:法定标准采用的分析方法或在不同实验室之间进行方法转移时应进行重现性试验。例如建立药典分析方法时，通过协同检验得出重现性结果。协同检验的目的、过程和重现性结果均应记载在起草说明中，应注意重现性试验用的样品本身的质量均匀性和贮存运输中的环境影响因素，以免影响重现性结果。B.数据要求均应报告标准偏差、相对标准偏差和可信限。11.7.3专属性专属性系指在其他成分(如：杂质、降解产物、辅料等)可能存在下，采用的方法能正确测定出被测物的特性。通常,鉴别反应、杂质检查、含量测定均应考察其专属性。如一种方法不够专属，可由其它分析方法予以补充。例如检测具有旋光特性的活性物质,除采用非手性薄层色谱法或高效液相色谱法外,还应增加旋光度的检查。专属性方法验证鉴别试验验证方法:专属性要求证明其能与可能共存的物质或结构相似化合物区分。含被测成分的供试品呈正反应，而不含被测成分的供试品以及结构相似或组分中的有关化合物，应均呈负反应。杂质测定（包括限度检查和定量测定)验证方法方法1：在杂质可获得的情况下，可向试样中加入一定量的杂质，考察杂质与共存物质能得到分离和检出，并具有适当的准确度与精密度。方法2：在杂质或降解产物不能获得的情况下，专属性可通过测定含有杂质或降解产物的试样，与另一个已验证的方法或药典方法比较结果。或对试样用强光照射，高温，高湿，酸（碱）水解或氧化的方法进行加速破坏，以研究可能的降解产物和降解途径，并比对破坏前后检出的杂质个数。必要时可采用二极管阵列检测和质谱检测，进行峰纯度检查。含量测定验证方法:方法1：在杂质可获得的情况下，可向试样中加入杂质或辅料，考察测定结果是否受干扰，并可与未加杂质和辅料的试样比较测定结果。方法2：在杂质或降解产物不能获得的情况下，专属性可通过测定含有杂质或降解产物的试样，与另一个已验证的方法或药典方法比较结果。或对试样用强光照射，高温，高湿，酸（碱）水解或氧化的方法进行加速破坏，用两种方法进行含量测定，比较测定结果。必要时可采用二极管阵列检测和质谱检测进行峰纯度检查，证明含量测定成分的色谱峰中不包含其他成分。11.7.4检测限（LOD）检测限系指试样中的被分析物能够被检测出的最低量。药品的杂质测定，应通过测试确定方法的检测限。定量限（LOQ）定量限系指试样中的被分析物能够被定量测定的最低量，其测定结果应具有一定的准确度和精密度。杂质和降解产物用定量测定方法研究时，应确定方法的定量限。用于能显示基线噪音的分析方法，即把已知低浓度试样测出的信号与空白样品测出的信号进行比较，计算出能被可靠地检测出的最低浓度或量。一般以信噪比为3：1或2：1时相应浓度或注入仪器的量确定检测限。信噪比法：一般以信噪比为10：1时相应浓度或注入仪器的量确定检测限11.7.6线性线性系指在设计的测定范围内，检测结果与试样中被测物的浓度直接呈正比关系的程度。线性是定量测定的基础，涉及定量测定的项目，如杂质定量测定和含量测定均需验证线性。A.验证方法应在设计的测定范围内测定线性关系。可用一贮备液经精密稀释，或分别精密称样，制备一系列供试样品的方法进行测定，至少制备5个浓度的供试样品。每一个浓度的样品3份，以测得的响应信号作为被测物浓度的函数作图，观察是否呈线性，用最小二乘法进行线性回归。必要时，响应信号可经数学转换，再进行线性回归计算。不同分析方法的线性验证和准确度验证需涵盖的最低浓度范围,见表11-8。含量测定:至少标示量的80-120%(ICH),推荐包含50%-150%的浓度杂质的定量测定:范围应根据初步实测，拟订为规定限度的±20%。如果含量测定与杂质检查同时进行，用百分归一化法，则范围应为杂质规定限度的-20%至含量限度（或上限）的+20%。推荐包含LOQ－规定限度的＋20%。B.数据要求应列出回归方程、相关系数和线性图。11.7.7范围范围系指能够达到一定的精密度、准确度和线性，测试方法适用的高低限浓度或量的区间。范围应根据分析方法的具体应用和线性、准确度、精密度结果和要求确定，要求见线性内容章节。11.7.8耐用性耐用性系指测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度,为使方法可用于常规检验提供依据。开始研究分析方法时，就应考虑其耐用性。经试验，应说明小的变动能否符合系统适用性试验要求，以确保方法有效。如果通过耐用性研究发现分析方法对某个或某些测试条件敏感或要求苛刻，则建议在方法中予以写明。液相色谱法(HPLC)中的典型影响耐用性的变动因素:1.流动相的组成2.流动相的pH值3.不同品牌或不同批号的同类型色谱柱4.柱温5.流速6．其他气相色谱法(GC)中的典型影响耐用性的变动因素1.不同品牌或不同批号的同类型色谱柱2.固定相3.不同类型的载体4.柱温5.进样口和检测器温度6．其他溶液的稳定性研究溶液的稳定性研究用来证明根据相应方法制备的样品溶液和标准品溶液在规定的储存条件下在一定时间内保持稳定。如果方法中没有规定有效期，样品溶液和标准