核酸提取原理及方法

前言核酸是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象，因此，核酸的提取是分子生物学实验技术中最重要、最基本的操作。2011年7月主要内容一．核酸简介二．基因组DNA提取三．质粒DNA提取四．真核细胞总RNA提取五．琼脂糖凝胶电泳2011年7月核酸简介核酸是由核苷酸或脱氧核苷酸通过3′，5′-磷酸二酯键连接而成的一类生物大分子。包括核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)两类。DNA主要储存遗传信息。RNA主要传递遗传信息。2011年7月？如何分离DNA？2011年7月核酸简介——质粒DNA质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子，大小从1-200kb不等，为双链、闭环的DNA分子，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌等细胞中，它具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。2011年7月一．核酸简介二．基因组DNA提取三．质粒DNA提取四．真核细胞总RNA提取2011年7月提取的几种常用方法：CTAB法SDS法其他方法2011年7月提取——CTAB法CTAB法原理（植物DNA提取经典方法）CTAB（hexadecyltrimethylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。该复合物在高盐溶液中（0.7mol/LNaCl）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。2011年7月提取——CTAB法CTAB提取缓冲液的经典配方组份Tris-HCl（pH8.0）EDTA（pH8.0）NaClCTABβ-巯基乙醇终浓度100mM20mM0.4M2%(W/V)0.1%（V/V）使用前加入Tris-HCl（pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；NaCl提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中；CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除。2011年7月提取——CTAB法CTAB提取缓冲液的改进配方组份Tris-HCl（pH8.0）EDTA（pH8.0）NaClCTABPVP40β-巯基乙醇终浓度100mM20mM0.4M3%(W/V)5%(W/V)2%（V/V）使用前加入PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。2011年7月CTAB法实验流程基因组DNA提取——CTAB法植物材料抽提核酸沉淀液氮研磨上层溶液细胞裂解DNA溶液干燥溶解离心洗涤2011年7月SDS法原理SDS是一种阴离子去垢剂，在高温（55～65℃）条件下能裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并降低温度（冰浴），使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀；上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。基因组DNA提取——SDS法注：SDS法适用于大部分实验材料基因组DNA提取。如动物组织、细胞、全血、细菌、酵母等。2011年7月SDS提取缓冲液的配方基因组DNA提取——SDS法组份Tris-HCl（pH8.0）EDTA（pH8.0）NaClSDS终浓度50mM20mM0.4M2%Tris-HCl（pH8.0）：提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA：螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；NaCl：提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中。2011年7月提取——SDS法SDS法实验流程（以动物组织为例）动物组织抽提酒精沉淀液氮研磨或匀浆上层溶液细胞裂解DNA溶液干燥溶解离心洗涤2011年7月电泳图琼脂糖凝胶电泳：以琼脂糖凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。2011年7月提取常见问题DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应DNA降解DNA量少2011年7月提取常见问题分析DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应DNA中含有蛋白、多糖、多酚类物质——抽提纯化、高盐洗涤DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应——重新沉淀DNA中残留有金属离子——重新70%乙醇漂洗2011年7月提取常见问题分析DNA降解材料不新鲜或反复冻融未很好抑制内源核酸酶的活性提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断外源核酸酶污染2011年7月DNA提取量少实验材料不佳或量少——选取新鲜（幼嫩）材料破壁或裂解不充分——充分研磨、破壁酶、延长裂解时间沉淀不完全——低温、延长沉淀时间洗涤使得丢失DNA基因组DNA提取常见问题分析2011年7月一．核酸简介二．基因组DNA提取三．质粒DNA提取四．真核细胞总RNA提取五．琼脂糖凝胶电泳2011年7月提取质粒DNA提取的方法：碱裂解法煮沸法2011年7月提取——碱裂解法原理2011年7月碱裂解法裂解细胞，离心吸附柱内的硅基质膜在高盐、低pH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA，再通过漂洗液将杂质和其它细菌成分去除，最后用低盐、高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。2011年7月提取及检测——实验准备1.实验器材台式高速离心机、旋涡混合仪、移液器、定时器、marker笔、电子天平、电泳设备、凝胶成像系统、微波炉、量筒、试剂瓶、锥形瓶等。2.实验耗材无菌2mL/1.5mLEP管、各规格Tip、一次性手套等。3.实验试剂质粒小提试剂盒（离心柱型，YRBIO)、LB培养基、抗生素、琼脂糖、DNALoadingBuffer、GoldView核酸染料、TAE电泳缓冲液等。4.实验材料对数期菌株（pEGFP-N1inDH5α）2011年7月提取——碱裂解法碱裂解法试剂配方组分1组分2Ⅰ液25mMTris-HCl（pH8.0）10mMEDTA（pH8.0）Ⅱ液0.2MNaOH1%SDSⅢ液3MKAc（pH4.2）RNaseA10μg/mlRNaseA洗脱液EB10mMTris-HCl（pH8.0）1mMEDTA（pH8.0）2011年7月提取——实验流程对数期菌体溶液III中和溶液I充分重悬溶液II裂解上清液过柱干燥溶解离心洗涤质粒DNA溶液离心详细实验步骤请参考说明书！2011年7月提取——电泳检测琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA的三种带型：1.共价闭合环状DNA分子：质粒双链没有断裂；超螺旋结构；泳动速度最快；2.半开环质粒DNA分子：质粒的一条链断裂；松弛的环状分子；泳动速度最慢；3.线性DNA分子：质粒的两条链均断裂；泳动速度居中。2011年7月提取常见问题RNA残留质粒断裂量少2011年7月提取常见问题分析RNA残留忘记加RNaseA？I液中RNaseA失效？酶量不够？2011年7月提取常见问题分析质粒断裂II液裂解时间过长？裂解时动作过于剧烈？2011年7月提取常见问题分析量少凝胶是否有问题？菌体量少菌体重悬不彻底裂解不完全菌株老化严谨型质粒2011年7月质粒类型•严谨型：这些质粒的复制是在寄主细胞严格控制之下进行的，与寄主细胞的复制偶联同步。所以，往往在一个细胞中只有一份或几份拷贝；•松驰型：这些质粒的复制是在寄主细胞的松弛控制之下进行的，每个细胞中含有10-200份拷贝，如果用一定的药物处理抑制寄主蛋白质的合成才会使质粒拷贝数增至几千份。如较早的质粒pBR322即属于松弛型质粒，要经过氯霉素处理才能达到更高拷贝数。2011年7月一．核酸简介二．基因组DNA提取三．质粒DNA提取四．真核细胞总RNA提取五．琼脂糖凝胶电泳2011年7月提取——通用方法异硫氰酸胍/苯酚法（TRIzol法）原理：核酸在中性条件下，因磷酸基解离而带负电荷，这一部分由于水化而溶于水。而在酸性条件下，磷酸基的负电荷消失，水溶性下降。因此，在酸性酚的处理下，DNA向疏水性的酚层移动，而RNA由于有-OH的存在有亲水性，因此向水层移动。2011年7月试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中。当加入氯仿时，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA进入水相，离心后可形成水相层和有机层，这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA便分离开。水相层主要为RNA，有机层主要为DNA和蛋白质。2011年7月提取及检测——实验准备1.实验器材台式高速冷冻离心机、移液器、定时器、marker笔、酒精喷壶、电子天平、电泳设备、凝胶成像系统（或紫外透射仪）、紫外分光光度计、微波炉、量筒、试剂瓶、锥形瓶等。2.实验耗材1.5mLEP管（RNasefree）、各规格Tip（RNasefree）、一次性手套、一次性口罩等。3.实验试剂TRIzol总RNA提取试剂（YRBIO)、氯仿、异丙醇、75%乙醇（RNasefree）、DEPCH2O（RNasefree）等。4.实验材料新鲜293细胞2011年7月RNase是导致RNA降解的最主要物质！RNase的来源样品试剂多次使用的器具裸露的手说话产生的唾沫空气RNase非常稳定，它在一些极端的条件可以暂时失活，但限制因素去除后有迅速复性。用常规的高温高压蒸气灭菌方法和蛋白抑制剂都不能使RNase完全失活。2011年7月提取——去除RNase污染玻璃器皿处理：量筒、试剂瓶等玻璃器皿须200℃烘