HIV核酸检测技术2014

HIV核酸检测及婴幼儿诊断HIV核酸检测的意义早期诊断婴儿的早期诊断：HIV感染母亲所生小于18个月龄的婴儿，不同时间的两次HIV核酸检测均为阳性即可作出诊断。18个月龄以上儿童诊断与成人相同：有急性HIV感染综合症或流行病学史，且不同时间的两次HIV核酸检测结果均为阳性，即可诊断。也可使用多样品集合的方法，对采供血机构的原料血浆以及HIV抗体阴性的高危人群样品进行集合核酸检测，及时发现窗口期感染，降低“残余危险度”，减少二代传播。疑难样本的辅助诊断在一般情况下，HIV抗体检测足以对HIV感染与否做出正确诊断，但在特殊情况下，单纯HIV抗体检测结果不能进行明确的诊断，如在感染早期或疾病终末期出现抗体不确定反应时，RNA的测定结果可帮助提供HIV感染早期或终末期的证据。由于试剂的灵敏度、接受有效的抗病毒治疗后以及存在长期低水平病毒的少数感染者等原因，应对其它检测数据和样品背景情况进行综合判断。遗传变异监测可用于HIV分子流行病学监测，包括HIV-1和HIV-2感染的鉴别诊断、HIV感染传播链的分析、HIV基因亚型和重组病毒的鉴定和分析以及人群HIV遗传变异趋势的监测耐药性监测可用于HIV耐药检测和监测，指导公共卫生医生了解耐药性病毒株流行的态势和指导临床医生判断抗病毒治疗效果和修改抗病毒治疗方案。病程监控及预测HIV感染发生后病毒载量变化具有一定规律，这种变化与疾病的进程有着密切的相关性。因此定期进行病毒载量检测有助于确定疾病发展的阶段，以确定相应的治疗方案指导抗病毒治疗及疗效判定通常在病毒载量达到一定水平后（如35，000～50，000c/ml）抗病毒治疗才显示良好的治疗效果。治疗后，通过病毒水平的检测能够确定治疗是否有效。通常在治疗6个月后病毒水平降低0.5log以上才被认为临床有效。样本采集原则样品恰当的采集、保存和运送是所有检测需要考虑的很重要的一部分。样品的采集和保存时，要使用无菌技术，包括消毒管、吸头和试剂及工作环境都要防止样品污染。样品的采集艾滋病检测最常用的样品是血液，包括血清、血浆和全血。病毒载量通常不使用全血。血清的检测结果大约是血浆的50％（30～80％），可能是因为HIV病毒颗粒被包裹在纤维蛋白网络中血浆中RNA量比血清中高并稳定。全血中病毒载量非常不稳定。EDTA抗凝的RNA比肝素、ACD好，并且肝素对PCR扩增有抑制作用。（用ACD抗凝的样品检测结果大约会比EDTA抗凝的样本低15％)采集的样品应在4～8小时以内分离血浆。样品的保存用于核酸检测的血浆和血细胞样品应冻存于－20℃以下，进行病毒RNA检测的样品如长期（3个月以上）保存应置于－80℃或液氮里。样品的运送病毒载量测定的样品应为血浆，样品应置于带螺旋盖的试管内，试管上应有明显的标记，标明样品的编号或受检者姓名、种类和采集时间。随样品应附有送检单，送检单应与标本分开，不能混放。在冷冻条件下运送，每一包装的体积不得超过50ml。实验室设置原则明确实验室的设置原则和工作流程设计，最终目的是为避免实验室污染。明确实验室设置和工作流程中好的和不好的实例。明确我们当前实验室设置中，为避免实验室污染有必要进行的整改。要点：各区必须是相互独立的，有条件各区内分别设置缓冲间，以保证不同区之间始终完全分开。各区的仪器设备以及各种物品必须专用。试剂准备区和样品处理区科保持低度正压或常压，是空气始终由室内流向室外，以避免扩增物进入此区。扩增产物分析区保持低度负压，可安装排风扇或其他排风装置。也可以设在远离其他各区的地方。工作时必须遵循单一工作流向进行，工作区域必须严格遵循单一方向顺序，即只能从试剂贮存和准备区、标本制备区、扩增反应混合物配制和扩增区(简称扩增区)至产物分析区。清洁方法不当也是污染发生的一个主要原因，因此实验室的清洁应按试剂贮存和准备区至扩增产物分析区的方向进行。不同的实验区域应有其各自的清洁用具以防止交叉污染。三实验室布局实例(备选1)实验室2实验室3“扩增后Lab电泳分析、测序反应和毛细管电泳实验室1“样品处理Lab样品接受储存MastermixpreparationRNA提取和第一轮PCR反应混合“扩增Lab第一轮扩增2ndroundPCRset-up第二轮扩增在密闭箱中以专用加样器操作样品FrozenplasmaWholebloodDBS13PCR工作站(Dead-airCabinets)15三实验室布局(备选2A)实验室2“样品处理和PCRLab样品接收储存提取和第一轮PCR反应混合样品FrozenplasmaWholebloodDBS1stroundamplification2ndroundPCRset-up实验室1“无模板Lab试剂储存主反应混合物制备实验室3“扩增后Lab第二轮扩增、电泳分析、测序反应和毛细管电泳在密闭箱中以专用加样器操作16三实验室布局(备选2B)实验室3“扩增后Lab1stroundamplification2ndroundPCRset-up第二轮扩增、电泳分析、测序反应和毛细管电泳如果不需进行nestedPCR，备选2B更理想样品FrozenplasmaWholebloodDBS实验室1“无模板Lab试剂储存主反应混合物制备实验室2“样品处理和PCRLab样品接收储存提取和第一轮PCR反应混合在密闭箱中以专用加样器操作试剂配制只能在规定区域完成，配制完后，试剂必须及时放回存放区。核酸提取在规定区域完成保证无菌、实验材料无菌并一次性使用保证无核酸酶污染加样和扩增只能在规定区域完成，加完后盖紧盖子并作好标记。操作超过10分钟时应将反应管置于冰盒内。扩增仪预热不少于20分钟扩增产物分析酶切、电泳、杂交等，在产物分析区完成定量检测通常采用商用系统。结果判定和报告定性检测：•HIV核酸检测阴性，只能报告本次实验结果阴性，不排除感染可能。•HIV核酸检测阳性，可作为感染的辅助诊断指标，不单独用于感染的诊断。•报告结果是应注明反应条件和引物序列。定量检测•按照读数报告结果，应注明使用的方法、样品种类和样品量。•测定结果低于最低检测限时，应注明最低检测限水平。低于最低检测的结果不能排除HIV感染。应附上仪器打印的数据。2020/2/2928常用的病毒载量测定方法▰分枝DNA信号放大系统HIV-1Quantiplex(bDNA)▰逆转录PCR系统AmplicorHIV-1Monitor（RT-PCR）▰核酸序列扩增系统NucliSensHIV-1QT（NASBA）2020/2/2929RocheBayer(前Chiron)Organon技术RT-PCRbDNANuclisensHIV-1QT结果比较约2xbDNA2.02.0版结果约为RT-PCR的50%，3.0版结果与Roche基本相同与Roche基本相同优点通过了FDA认证假阳性结果较bDNA少1.5版对A-G亚型有较好的反应性操作时间较少对A-G亚型有较好的反应性通过了FDA认证可使用多种组织，如生殖道分泌液对A-G亚型有较好的反应性检测范围大缺点操作容易污染测定范围较小（相对于NASBA）少数生物样品反应受抑制，如精液、乳汁和唾液早期版本对部分亚型反应性较差，1.0版对非B亚型的样品反应性普遍较差，（5）版通过改进对O亚型检测能力较差对低值样品检测的特异性较差。无内部质量控制，尤其在3.0版中为单孔检测时，无法控制由于提取或加样操作的失误。不同版本间差异较大，2.0版约为RT-PCR50%，3.0版结果与Roche基本相同表明两个版本间差异可能达到50%。对除血浆、血清外的大部分体液样品无法进行检测。对抗凝剂敏感，只能使用EDTA。早期版本（NASBA）对部分亚型（G亚型）反应性差。操作复杂，样品提取(不使用自动提取仪时)和测定反应时需要进行大量的手工操作。不适合一次大量检测，ECL读数仪每次只能进行12个样品的检测。实验内、外误差相对较大。检测范围标准版(Amplicor1.0及1.5)400-750,000c/mL超敏版(Ultra-Direct1.0and1.5):50-75,000c/mLbDNA3.0版:100-500,000c/mLNuclisensHIV-1QT:40-10,000,000c/mL(取决于样品量)各种HIV定量检测方法的比较2020/2/2930关于不同HIV定量检测方法的选择目前用于统一不同定量方法检测值的标准品还没有问世不同定量方法结果之间还无法直接比较同一病人治疗前后建议用同一方法进行HIV定量检测2020/2/2931提高敏感性的方法▰增加标本用量，例如从500µl血浆增加到1ml▰离心沉淀病毒颗粒，离心时间从60min延长到80minat23,600xg▰减少内部定量标准的体积，例如从25µl减少到6.6µlperlysisvial▰减少沉淀的病毒重悬的体积，例如从100µl减少到55µl▰加底物孵育时间延长10–15min2020/2/2932假阳性(FalsePositive)控制污染物理隔离PCR前后的反应器械专用（加样器、吸头、离心机、离心管、手套、工作服、笔）分装试剂阳性和阴性对照最近的进展防气溶胶吸头半自动操作封闭试管系统（实时PCR）全自动（样品处理＋扩增＋检测）2020/2/2933假阴性(FalseNegative)原因序列变异丢失核酸样本核酸样品被消化抑制DNA聚合酶的活性预防避免肝素、血红蛋白、乙醇、酚、SDS使用合适的提取技术检测阳性对照内部对照选择病毒载量检测的注意事项方法的线性范围、特异性、重复性、对不同亚型的检测性能检测试剂和耗材等消耗品对人员和实验室的要求、可操作性样本的运输、保存、样品量质量控制：污染控制、室内控制和室间控制自动化操作程度检测时间病毒载量测定的基本要求仪器需要按公司要求的进行定期维护加样器的校准水浴箱的温度校准实验室的处理检测实验室的分区婴幼儿HIV感染核酸检测HIV感染产妇所生婴幼儿在出生后18个月内可应用HIV核酸（DNA或RNA）检测进行早期HIV感染诊断。尽管HIVRNA检测敏感性在感染早期较高（出生后1个月内），但是HIVDNA检测不受母亲围产期抗逆转录病毒治疗和人乳汁中抗逆转录病毒药物以及婴幼儿预防性抗逆转录病毒治疗的干扰而影响早期诊断。另外，考虑母亲血液污染因素，不推荐使用脐带血进行HIV核酸检测。适用范围未满18个月的HIV感染产妇所生婴幼儿；未满18个月的婴幼儿，其母亲HIV感染状态不详，儿童出现HIV相关临床表现，临床怀疑HIV感染者检测程序及结果报告滤纸片载体及其特性（1）作为血液载体，滤纸应具备极强的吸水性、厚度均一、液体流速一致、纯度高、没有污染、FDA在册，据不同的检测需求选择不同类型的滤纸。滤纸干血斑样本特点（1）需要样本量少，仅50-100μl；易采集，末梢血即可，适用婴儿和静脉采血困难者；样本安全，生物危险性低，费用低廉的运输方式，可直接邮寄，被IATA归入最低危险水平；室温保存减少了保存费用，密封袋中加干燥剂和湿度指示剂.滤纸片载体及其特性（2）滤纸选择指南样本采集滤纸类型检测对象是否长时间常温保存是否关心杀菌剂、杀毒剂、抗真菌成分是否样本含有色素如：血液、粪便、血清、植物或哺乳细胞样本是否为清洁的生物性液体入：口腔粘膜细胞、精液、尿液DNAproteinRNAS&S903√√√否*否是否Isocode(FTA标准卡)√是是是否IsocodeID（FTA指示型卡）√是是否是*903滤纸上的样本可在-20℃长期保存，蛋白的保存时间依据特异蛋白特性，见后。滤纸片干血斑作为一种有效载体在HIV检测中具有非常重要的作用定性检测HIV抗体定量检测HIV的病毒载量HIV耐药性检测HIV新发感染的检测快速检测的一种质控手段定性检测前病毒DNA,婴幼儿早期诊断HIV耐药检测抗病毒治疗的效果：●大幅度降低病毒载量●提升CD4细胞数●改善症状，延长生存期。抗病毒治疗存在问题：●毒副作