1动物胚胎工程实验教程小鼠卵的体外成熟与体外受精材料与方法

《动物胚胎工程实验教程》王子玉自编南京农业大学动科院2005年8月实验一小鼠卵母细胞的体外成熟实验一、实验目的熟悉雌鼠的生殖器官的结构特点；掌握小鼠的超数排卵方案；掌握从卵巢上扎取未成熟卵母细胞的方法、卵母细胞的分类方法、体外成熟培养方法及核成熟情况和卵丘扩展程度的观察。二、实验器材和材料1.器材及药品体视显微镜，手术器械（眼科剪，眼科镊），1mL注射器，胶头滴管，口吸管，CO2培养箱，水浴锅，移液器，枪头，塑料培养皿，记号笔。操作液（M2），成熟培养液（M－199），激素（PMSG和HCG），石蜡油。2．实验动物：3-4周龄昆明系雌性小白鼠，自由采食饮水。三、实验内容1.小鼠的超数排卵注射剂量皮下或腹腔注射PMSG10IU/只小鼠。注射方法皮下注射：用手指捏住小鼠的头及尾部固定（图1-1），以酒精棉球消毒其背部，提起皮肤，将注射针头平插刺入皮下，将针头微向上挑起不露出针尖时，再注入药物。随着药物的推入，在皮下可看到鼓起一个小泡，即证实药物确已注入皮下部位。皮下注射时防止药液从针孔处逸出。腹腔注射：针头刚进入腹腔后向上挑，防止损伤小鼠腹腔内器官。注射针头宜选用小号细针头。注射药物后的小鼠自由饮水、采饲，自然光照。2.卵巢的采集方法在注射PMSG后46h利用颈椎脱臼法处死小鼠（将供体鼠置于饲养笼上，鼠爪自然抓紧笼上铁支架，此时一只手拉紧鼠尾，另一只手食指与拇指压紧鼠颈部，或用镊子压紧颈部即可致死，此为引颈法。用75%酒精喷湿鼠全身以消毒并防止毛发飞扬）。将小鼠头部固定，用力牵拉鼠尾，可感到颈椎部位脱臼的振动；也可用食指和拇指直接掐断颈椎致死。然后用图钉将小鼠呈仰卧姿势固定于小木板上或鼠解剖台上。图1－1小鼠的固定将处死并固定好的小鼠，在下腹部中间剪开1个小口，一只手抓住鼠尾，另一只手抓住切开的皮肤向头部牵拉直至充分暴露腹部（图1-2）。剪开腹膜，向前方揭去肠胃内脏，即暴露出生殖器官，可在肾脏后方看到两侧呈乳白色的卵巢及与输尿管相平行的两子宫角（图1-3）。取出卵巢，在灭菌滤纸上剔除卵巢周围的脂肪组织和输卵管，用M2清洗两遍，洗去血液和脂滴。3．小鼠生发泡期卵母细胞的获取13425AB图1-2小鼠剖腹过程A.皮肤剪切过程B.腹腔剪切过程1.皮肤剪切2.皮肤剥离方向3.肝部4.腹膜5.脾脏6.腹腔剪切线61234图1-3小鼠卵巢与子宫的解剖位置1.卵巢、输卵管、脂肪块2.子宫3.脂肪块（体成熟小鼠才有）4.膀胱图1-4卵子结构模式图1.放射冠2.透明带3.卵黄膜4.卵黄5.胞核把卵巢置于M2操作液中，在实体显微镜下，用针头挑破卵巢表面的有腔卵泡，这时应能看到卵母细胞从卵泡内流出，若未流出，可用针头挤压一下，尽量每一个大腔卵泡都要刺破，在操作过程中注意添加操作液并轻轻振荡，防止扎出的卵母细胞凝集成团。4．卵母细胞的分类将巴氏吸管在火焰上拉细，并用砂轮断末端，制备吸卵针，其尖端直径约200µm（可事先制备）。收集扎出的所有卵母细胞，根据卵丘状态，直径大小、胞质颜色及有无颗粒等可分为以下几类：（1）A类COC：达到最大直径（70µm），卵丘完整而且致密，层数在三层以上，卵母细胞形状规则，胞质均匀无颗粒，胞质颜色正常，呈均匀的浅黄色，仔细调节显微镜可见核仁和生发泡（图1-4）。（2）B类COC：卵丘松散，只有少数几层卵丘或只带有部分卵丘，生发泡和核仁清晰，其余指标同A类卵。（3）NO（天然裸卵）：基本不带卵丘，生发泡和核仁清晰，其余指标同A类卵。（4）退化卵：符合以下条件中的一项：胞质不均匀，出现颗粒；胞质颜色发黑或过浅；卵丘已扩展；生发泡破裂；带第一极体；卵周隙过大或消失。5．卵母细胞的培养本实验只选择A类COC用于培养，将其在操作液中洗净（三遍以上），然后用培养液洗1－2遍。成熟培养液为TCM-199添加10%（V/V）FCS（胎牛血清）、2mM谷氨酰胺，0.23mM丙酮酸钠，10IU/mLPMSG。所有的培养液和操作液都加入50IU/mL的青霉素和链霉素。采用微滴培养体系，严格控制培养条件，培养滴大小为80μl，表面覆盖薄层石蜡油，在培养箱中预平衡2h后用于培养，每滴培养15枚左右卵母细胞。将洗净的卵母细胞移入已平衡好的培养液滴中，置于37.5℃，5％CO2，95％空气，100％湿度的CO2培养箱内进行培养。6．卵母细胞核成熟情况的观察卵母细胞核成熟分为以下几个时期：（1）生发泡（germinalvesicle,GV）期：卵内有一个较大的核，位于近边缘处，核膜清晰，其中有一个或几个核仁。（2）中期初期（prometaphase,PROM）：可以作为GVBD的鉴别标准。核膜和核仁消失，染色质凝集成团块状。（3）中期Ⅰ(metaphaseⅠ,MⅠ)：染色体已经形成，并有规律地排列于赤道板上。但由于压片的原因，往往只能看到数十条染色体聚拢在一起。（4）后期Ⅰ和末期Ⅰ(anaphaseⅠandtelophaseⅠ,AnaⅠ/TelⅠ)：可以看到两团染色体存在，其中一团将成为卵母细胞的MⅡ期染色体，另一团则将形成第一极体。（5）中期Ⅱ（metaphaseⅡ,MⅡ）：在卵周隙中见到第一极体（1Pb），无疑就是MⅡ期卵母细胞。本实验把PROM、MⅠ、AnaⅠ/TelⅠ均归为GVBD期，COC培养一段时间（0h，2h，6h，14h）后，把COC移入0.1%透明质酸酶中作用1min，用适当口径的口吸管反复吹打，将卵丘细胞去净。在体视显微镜下观察GV、GVBD和1Pb。7．卵丘扩展的观察在成熟不同时间（0h，2h，6h，14h）观察卵丘状态，根据Vanderhyden（1993）的标准将卵丘扩展的程度分为为0－4级：0级：无扩展；1级：最外层的约1－2层卵丘有扩展；2级：外面的几层细胞开始呈放射性扩展；3级：内层的卵丘细胞也已经扩展，只有放射冠未扩展；4级：包括放射冠在内的全部卵丘都扩展，而且外周部分细胞已开始脱落。四、作业1．记录小鼠的编号及获得的各类卵母细胞的数目及总数。2．记录成熟不同时间的处于不同核成熟阶段的卵母细胞数目及百分比。培养时间（h）卵数发育阶段（％）GVGVBDMⅡ026123．记录成熟不同时间的处于不同卵丘扩展阶段的卵母细胞数目及百分比。培养时间（h）卵数卵丘扩展程度（％）0、1、23、40h3h6h12h4．简述实验中的注意事项。5.简述小鼠卵母细胞体外成熟的步骤。实验二小鼠的体外受精实验一、实验目的熟悉雄鼠的生殖器官的结构特点；掌握从输卵管上取成熟卵母细胞的方法；掌握从附睾尾部取精子的方法、精子的体外获能和体外受精方案、受精率的观察。二、实验器材和材料1.器材及药品体视显微镜，手术器械，1mL注射器，胶头滴管，口吸管，CO2培养箱，水浴锅，移液器，枪头，塑料培养皿，记号笔，血细胞计数板、载玻片、盖玻片。0.1％透明质酸酶，卵母细胞操作液（M2），精子操作液和受精液（T6），胚胎培养液（CZB，有糖和无糖）、激素（PMSG和HCG），石蜡油。2．实验动物：3-4周龄昆明系雌性小白鼠和8-12周龄雄鼠，自由采食饮水，控光一周以上，暗光时间20：00-6：00；光照时间6：00-20：00。三、实验内容1．体内成熟卵母细胞的获取超排方法是15：00腹腔注射PMSG10IU/只小鼠。48小时后腹腔注射hCG10IU/只。注射hCG后14-15h，利用颈椎脱臼法处死小鼠（方法同实验一），取输卵管于M2操作液中，清洗两次，在体视显微镜下用眼科镊子撕开输卵管壶腹部释放出卵丘卵母细胞复合体团，用口吸管吹打几次，把COC团分散开。2．体外受精2．1取精子选取性成熟（8周）昆明白雄鼠，已通过交配实验证明其有受精能力，颈椎脱臼法杀雄鼠，打开腹腔，将附睾尾部和输精管剪下，剔除脂肪，在实体显微镜下，用镊子和针头配合，挤出输精管内精子，针头刺破附睾尾部上皮，用针头挤压出精子（图2-1）。图2-12．2精子的洗涤在小鼠上可省略，但在大动物上必需，洗涤可除去获能抑制因子、卵黄、甘油等。2．3精子的获能马上收集精子团块，置于1.5mL离心管中，加入1mL含10mg/mLBSA的T6，轻微振荡几次，使精子团分散开，用封口膜封口，于37.5℃，5％CO2，95％空气，100％湿度的CO2培养箱内中孵育1.5h左右。2．4精液品质检测主要检测活力和密度，方法参考《动物繁殖学实验教程》。2．5体外受精将成熟的COC移入已经平衡2h的受精滴中（T6+20mg/mL），加入适量体积的获能精子，使精子密度在1×106右，置于培养箱中孵育8h，观察原核形成和第二极体排出，计算受精率。3．胚胎培养洗去精子，将胚胎换液于无糖CZB继续培养。胚胎过阻断之后（4－cell）换为含葡萄糖的CZB，换液时间在有1/3的胚胎到达4－cell后进行，大约在受精后36h－48h之间。在受精后24h、48h、72h、96h各观察一次，记录2－cell、4－cell、桑椹胚、囊胚的发育情况。四、作业1．计算本实验的受精率、卵裂率和囊胚发育率。鼠号卵数受精率卵裂率囊胚率2．简述实验中的注意事项。3．简述体外受精的步骤。