微生物农药

第二章微生物农药昆虫数量和种类很多危害农作物，传播疾病等无机和有机砷化物DDT（20世纪40年代）作用于昆虫神经与肌肉组织杀灭多种昆虫•我国每年因病虫草鼠害造成的经济损失达500亿元，如果不使用农药农作物粮食会损失50%，使用农药防治则挽回损失的15%。90年代我国农药生产已跃居世界第二位。•众所周知,化学农药在人类战胜病虫害中曾经起到不可估量的作用,但也给人们带来了不少“麻烦”。最典型的要算DDT。1939年瑞士化学家米勒发现了这种化学物质的强大杀虫能力,1943年盟军占领意大利那不勒斯,遭到斑疹伤寒、虱子的威胁,司令部下令,所有的军人和老百姓必须在大街上接受DDT溶液喷洒,果然虱子全灭,疾病绝迹。此后,它成了消灭蚊蝇、预防传染病、杀灭某些农作物害虫的主要药物。米勒也因此获得了1948年度诺贝尔生物和医学奖。如今,这种曾一度风光的化学物品被国际社会打入“冷宫”,禁止生产和使用。原因是它具有高度稳定性,生物难以降解而积累于体内,还有的残留于水源、大气、土壤中,不仅危害动植物本身,甚至直接或间接进入人体,殃及我们的健康和生命。•危害主要表现为：（1）有机氯农药不仅对害虫有杀伤毒害作用，同时对害虫的“天敌”及传粉昆虫等益虫益鸟也有杀伤作用，因而破坏了自然界的生态平衡。•例如瓢虫、草蛉、食蚜蝇、食虫椿象的大量死亡，使蚜虫，红蜘蛛等害虫的繁殖速度大增。•（2）长期使用同类型农药，使害虫产生了抗药性，因而增加了农药的使用量与防治次数，也大大增加了防治费用与成本。近些年,棉铃虫对溴氢菊酯的抗药性已增加到55-89倍。（3）长期大量使用农药，使农药在环境中逐渐积累，尤其是在土壤中，产生了农药污染环境问题。（4）农药被农作物吸收、进入动物体内，经过生物富集浓缩，使其毒性更大，这就不仅使得害虫的天敌更易受到毒害作用，而且会通过食物链威胁人体的健康,导致慢性中毒。•有机氯农药积累干人体内脂肪、肝脏、肾脏，损害肝肾功能，引起贫血、血细胞增多和中抠神经性病变，也可能致畸和致癌。有机磷农药可以引起细胞遗传物质大改变，有致突变或致癌作用。•全球每年有500万人因接触化学农药和误食而死亡。•我国农村儿童白血病患者近50%的诱因是化学农药。•20世纪90年代,我国虽然已禁用DDT10年,但对南方某市52名哺乳妇女母乳DDT的检出率竟然为100%。1984年12月3日印度博帕尔事件液态剧毒性异氰酸甲酯，制造农药西维因和涕灭威的原料•生物农药步伐缓慢原因:•(1)生物农药具有无毒副作用、不污染环境等优点，但与化学农药相比有一个明显的缺点，即施用之后药效反应慢，而且稳定性也较差，特别是活体微生物为有效成分的产品，生物活性下降很快，产品的质量保证期短。就农民的用药心理而言,希望施用农药后药到虫除，而生物农药多数要在三四天后才能见到效果。因此，难以适应农业生产快速除虫的需要。•(2)生物农药生产企业一般规模较小，厂房简陋、设备落后、资金短缺，由此而导致成本偏高，在价格上无优势。我国现有农药生产企业2000多家，其中生物农药生产企业约400家，但是规模较大的生物农药生产企业只有4~5家。这样的产业布局，造成了产品质量不稳定，商品剂型化程度低，在与国外产品竞争中，缺乏竞争力。而国际上农药业主要由7家大公司控制，其销售量占全球农药销量的90%。•(3)生物农药产业在我国没有得到足够的重视。世界上主要发达国家政府均已陆续公布了禁用或限用化学农药名单，并制定规划发展生物农药。目前，每年新研制成功和登记注册的生物农药品种以4%的速度递增，到2015年生物农药占所有农药的份额将由现在的2%~3%增加到50%。我国虽然在《中国21世纪议程》中提出发展生物农药，农业部成立了绿色食品发展中心，国家环保总局成立了有机农业食品发展中心，一些省市也已公布了在蔬菜瓜果上禁用的剧毒品、高毒化学农药名单，但迄今没有国家统一的有关禁用限用剧毒、高毒、高残留化学农药的法规，也没有一个倡导和支持大力发展生物农药的中长期发展规划。•(4)由于新药筛选成功率愈来愈低，对新药性能的要求愈来愈高，因此新药筛选越来越困难。筛选化学农药的机率只有二万分之一，而生物农药的成功率是五千分之一。与生物农药相比，化学农药的开发周期3倍于生物农药，开发费用40倍于生物农药，注册费则是生物农药的100倍。这种状况迫使企业寻求新的发展途径，用更多的投入来开发生物农药。•随着全民健康意识和环保意识的提高，生物农药的推广必将成为今后农药发展的主流趋势。•目前，瑞士先正达、德国巴斯夫、日本武田制药、美国孟山都等跨国公司已经进入中国生物农药市场。加入世界贸易组织后，我们所面对的不仅是国内市场，而且是国际大市场，市场竞争将更加激烈。因此，为适应国际竞争环境，生物农药必须“有所作为”。微生物农药：由微生物体产生的具有防治病虫害和除杂草等功能的代谢产物或活菌体.范围：微生物杀虫剂、微生物杀菌剂(农用抗生素)、微生物除草剂、微生物生长调节剂生物防治：用生物农药来对病虫害和杂草进行防治优点：不污染环境，有效控制病虫害，杂草；保持生态平衡我国微生物农药主要以井岗霉素和Bt为主，从品种、剂型、质量和数量上与发达国家相差甚远，还远远不能满足国内外市场的需求。在2001年国家计委高技术产业化示范工程项目中，天然植物源杀虫剂菊酯、年产6000吨“武大绿洲”系列生物病毒杀虫剂、真菌生防制剂、复合微生物活菌制剂和年产5000吨的寡聚糖生物农药5个生物农药项目获得批准。2002年又批准年产3000吨“安徽奥绿”系列生物病毒杀虫剂、年产1万吨宁南霉素、线虫生防制剂和年产3万吨固体发酵Bt等生物农药项目。一.微生物杀虫剂控制害虫更为安全、有效的方法微生物杀虫剂的优点：特异性高、不伤害天敌、无毒可进行生物降解昆虫对它的抗性产生较慢微生物杀虫剂的不足：杀虫效果较差•目前已经在生产上广泛应用的昆虫病原微生物包括真菌、细菌和病毒。（一）细菌杀虫剂•在已知的病原细菌中，作为微生物杀虫剂在农业生产中大量使用的是苏云金杆菌(Bacilusthuringiensis)（Bt生物杀虫剂）和日本金龟子芽孢杆菌。•因细菌致病的害虫，虫体发软变色，有臭味。•日本金龟子芽孢杆菌则用于防治金龟子幼虫。1、Bt生物杀虫剂•(1)发展及应用:•1902年发现，1951年发现商业价值。•20世纪80年代，世界上Bt生物杀虫剂总产量仅8000吨，美国占1000吨。•我国生物农药研究开发起步较晚，但随着国家对Bt生物杀虫剂等研究开发和推广的日益重视，“六五”至“十一五”国家科技攻关设专题研究，Bt生物杀虫剂的品种、发酵水平有很大提高，并相继推广。Bt生物杀虫剂可大规模工业生产，产量达2-3万吨/年，并在20多个省市推广用于防治粮、棉、果、蔬、林等多种害虫。寄生于130多种鳞翅目、膜翅目、双翅目、直翅目和鞘翅目幼虫体内；控制毛虫、毒蛾、白菜金翅夜蛾、烟草天蛾等.注:对家蚕有致病作用,可用0.3%的漂白粉消毒3分钟即可解除毒性.(2)生理生化特性:苏云金杆菌：G+，短杆菌，形成芽孢，周身鞭毛或无鞭毛，伴孢晶体(典型为菱形、也有圆形、方形、椭圆形、不规则形)•Bt对营养条件要求不高。所需主要营养物质属动植物蛋白质衍生物。能在多种N源，碳源和无机盐中正常发育。通常所利用的营养是:•碳源:淀粉、糊精、麦芽糖、葡萄糖、直接为Bt吸收利用•N源:牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、花生饼粉、豆饼粉、鱼粉、玉米浆等。•无机盐:K2HPO4、MgSO4、CaCO3。主要元素有磷、硫、镁、钾、钠、钙6种，微量元素的锰、锌、硅、铁等，微量元素所需甚微，水杂质即可满足，多了有毒。•温度:10-40℃都能生长，以28-32℃较适。35-40℃生长很快，但易衰老，温度低则生长缓慢。因此在一定范围内提高t会缩短生长期，但菌数量会降低;而t低则生长慢，生长期延长，菌数相对来说则增高。•pH:与其他细菌类似，该菌适于微碱性条件，最适pH是7.5，当pH达8.5时还能形成芽孢，如pH降至5以下则不能形成芽孢。••氧:是一种好氧细菌，需要充足的空气才能生长发育良好。尤其当芽孢形成时，若缺乏足够的空气时会延迟芽孢的形成或不能形成。它还影响到生长速度、菌数和晶体。在深层培养时通气不良会造成细菌溶解，使菌数降低。•紫外线:阳光对芽孢都有致死作用。芽孢暴露在紫外光下很快失活:1分钟失活12%、2分钟50%失活。10分钟99%失活。在自然阳光下，30分钟50%失活，60分钟80%失活。在290-400nm处死率最高。•抗生素及化学物:放线菌素D、氯霉素、红霉素及一些化学物质都有影响。乳化剂对芽孢萌发有抑制作用，TritonX-100在100μg/ml时，全部抑制了芽孢萌发。苏芸金杆菌的营养体苏芸金杆菌的孢子囊BT致鳞翅目幼虫死亡症状（3）、致病机理主要靠芽孢和毒素芽孢在肠道中萌发，大量增殖，穿透肠壁进入血液，引起昆虫败血症毒素：主要是晶体毒素和毒素晶体毒素是所有Bt共有的毒素，存在于伴孢晶体中，在肠内晶体毒素水解为毒性的短肽，穿过肠壁，形成败血症。毒素是胞外毒素，水溶性，热稳定性好，是RNA聚合酶的竞争性抑制剂，伴胞晶体（1）日本金龟子芽孢杆菌形态2.日本金龟子芽孢杆菌（2）日本金龟子芽孢杆菌致病症状3.Bt杀虫剂的特点•(1)高效,对人畜无毒,不污染环境.•(2)不杀伤害虫天敌,保持生态平衡.•(3)对植物无毒害,不影响作物的色,香,味.•(4)抗性产生缓慢.•缺点:选择性强,杀虫谱窄;杀虫速度慢;受气温影响;对蚕有毒;不受专利保护.4.苏云金芽孢杆菌的生产•见书181页5.苏云金芽孢杆菌的检测5.1菌体含量测定使用分光光度计在278或680nm处测菌体浓度.LC50:引起群体一半死亡的杀虫剂浓度.•5.2生物效价测定•(1)取7个带玻璃珠的锥形瓶,分别做上如下标记:1#、2#、…、7#.往1#瓶中加入200mL自来水和600mg标准品,混匀备用.分别往2#-7#瓶中加200mL自来水和600mg32000IU·mg-1效价的Bt原粉,再分别往2#-7#瓶中加100μL的助剂,即BCM-101、JFC、6501、B-10250、SD-1227A.将锥形瓶放置在摇床上摇30min;将下摇床的锥形瓶药液按1.5倍稀释成5个浓度;每个浓度分别用60mL稀释液浸叶片.•(2)取大小一致的小白菜叶片(经自来水浸泡、冲洗,并自然晾干),分别浸入不同浓度的药液中;浸10s后取出,立即用滤纸吸干叶片上多余的药液,并放在搪瓷盘中自然晾干;最后将其置于小烧杯中,每个烧杯放入2片叶子.•(3)挑取出2龄棉铃虫幼虫放置于小烧杯中,烧杯内放一小团浸过自来水的棉花球.每处理试虫10头,用双层纱布捆绑好,在室温、相对湿度60%-80%的条件下饲养.•(4)24、48h检查死亡虫口数,计算死亡率.重复4次.•(5)进行死亡率、LC50及效价的统计.•测试品效价=(标准品LC50/测试品LC50)×标准品效价.5.3伴孢晶体含量测定•取发酵液样品加入1%溶菌酶,30℃恒温下充分研磨至镜检60%~70%菌体细胞壁破碎,再用超声波处理30s打碎细胞,参照LaemmLi(1951)方法进行SDS-PAGE凝胶电泳,浓缩胶浓度为4%,分离胶浓度为10%,加10%SDS,电泳后的聚丙烯酰胺凝胶经过考马斯亮蓝染色后再脱色处理。运用ImageMasterID软件对蛋白质进行定量分析。•5.4湿润性检测•取7个250mL的烧杯,做上标记.每个烧杯装入100mL自来水.用托盘天平分别称取每种混粉5.0g,以5.0gBt原粉作为对照.将混粉倒入烧杯中,测出原粉完全沉入水中所需的时间,(时间越少,湿润性越大),并记录检测时间.•5.5pH值测定•取7个100mL的烧杯,做上标记.将每个烧杯装入大约50mL的蒸馏水.用托盘天平分别称取每种混粉1.0g,以1.0gBt原粉为对照.将称好的样品倒入相应的烧杯,用玻璃棒搅拌均匀,将烧杯加满蒸馏水,搅拌均匀,静置10min.用电子酸度计测出其pH值.•5.5水分检测•取7个称量瓶,做上记号,放入恒温烘干箱中使水分烘干.将烘干的称量瓶放在电子天