病毒学(Virology)

病毒学（Virology）病毒学是研究病毒这一特殊生命形式的性质及其与宿主相互作用的关系的自然学科，是跨生物学、医学、农学的交叉学科，是分子生物学研究领域的前沿学科。第一章绪论第一节病毒学研究的对象与任务一、病毒学研究的对象病毒（Virus）是一种特殊的生命形式，是一种极为简单的生命形式。（一）病毒的特点1、病毒结构简单(1)不具有细胞结构(2)只具有一种核酸（DNA或RNA）(3)不含核糖体和完整的酶系统，也不具有能量合成和代谢系统。2、独特的繁殖方式(1)不具有双分裂(2)以复制方式进行繁殖3、绝对的细胞内寄生4、病毒的二重性(1)病毒存在形式的二重性*细胞外具有感染性的颗粒形式*细胞内具有繁殖性的基因形式(2)病毒结构形式的二重性*完全病毒与缺损病毒（defectvirus）*病毒与假型病毒(pseudotypevirus)、假毒粒(pseudovirion)*病毒颗粒与空壳(3)病毒来源的二重性*外源性病毒从细胞外到细胞内在细胞间水平传播的病毒*内源性病毒在宿主发育早期感染宿主，病毒基因组整合于宿主基因组并与其同步复制，随细胞分裂垂直传递给子代细胞，但因其受宿主细胞控制，病毒基因组只能部分表达，故没有子代病毒产生，且对宿主一般不造成伤害。（二）病毒的定义病毒是占据一定生境，并具有独立于其宿主进化史的绝对细胞内寄生物，其基因组（DNA或RNA）被其自身编码的蛋白质外壳所包围。(三）、病毒的宿主范围宿主范围：病毒所能感染的宿主和宿主细胞的种类按宿主种类划分EuvirusVirusSubvirusViroidSatelliteagentSatelliteRNASatellitevirusPrion病毒（Virus）噬菌体（Phage）植物病毒（PlantViruses）动物病毒（AnimalViruses）噬菌体（bacteriophage）噬蓝绿藻体（cyanophage）支原体噬菌体（mycohasmemaphage）植物病毒（plantviruses）噬藻体(phycophage)真菌噬菌体或真菌病毒(mycophage)原生动物病毒(protozoalviruses)无脊椎动物病毒(invertebleviruses)脊椎动物病毒(vertebleviruses)医学病毒(medicineviruses)兽医病毒(eterinaryviruses)昆虫病毒（insectviruses）PlantVirusesInsectVirusesAnimalViruses虫媒病毒（arbovirus）以蚊、蜱、螨、白蛉等节肢动物为媒介，在脊椎动物中广泛传播的病毒。（四）、病毒的起源三种假说：–病毒起源于细胞的DNA/RNA–病毒的退行性进化假说–病毒起源于具有复制能力的寡聚核苷酸逆转录因子（retroelement）逆转子（retron）逆转录子（retroposon）逆转录转座子（retrotransposon）逆转录病毒（retroidviruses）逆转录病毒（retroviruses）副逆转录病毒（pararetroviruses）嗜肝DNA病毒（hepadnaviruses）花柳菜花叶病毒（canlimoviruses）四、病毒学研究任务理论方面：推进现代生物学的发展应用方面：–控制和消灭危害人类健康和社会发展的病毒危害–利用病毒对有害生物进行生物防治–促进生物高新技术的发展第二章病毒学研究的基本方法一、病毒的分离（一）标本的采集与处理（二）标本的接种：实验宿主（动物、植物或细菌），鸡胚或细胞培养（三）病毒存在的认定1、系统症状2、局部反应(1)噬菌体—噬菌斑(plaque)噬菌体感染生长在营养琼脂平板上的细菌所形成的，具有一定大小和形状的透明区域。(2)动物病毒—蚀斑或称空斑(plaque)动物病毒感染单层细胞培养所形成的局部病损区域，系由病毒的致细胞病变作用所引起．致细胞病变作用（Cytopathiceffect，CPE）：病毒感染细胞培养引起的细胞显微表现的改变，如细胞聚集成团，肿大、园缩、脱落、细胞融合形成多核细胞、细胞内出现包涵体（inclusionbody），乃至细胞裂解等（３）植物病毒－坏死斑或称枯斑（necrosisspot）植物病毒感染敏感植物叶片所形成的局部病损区域．（四）盲传（blindpassage）将取自经接种而末出现感染症状的宿主或细胞培养的材料，再接种于新的宿主或细胞培养，以提高病毒的毒力或效价．二、病毒的纯化(一)病毒的纯化1.病毒纯化的标准(1)纯化的病毒制备物应保持感染性(2)纯化的病毒制备物应具有均一性病毒制备物均一性检查的方法包括：电镜检查、超速离心、电泳和免疫学方法（二）病毒纯化的方法1,病毒纯化方法的依据(1)病毒颗粒具有一定的大小和密度，在离心场中能以一定的沉降速率沉降(2)病毒颗粒的主要化学组成为蛋白质2.病毒纯化的方法包括:超速离心,沉淀法,凝集技术,液态两相分配系统,有机溶剂萃取,层析和电泳等三、病毒的测定（assayofvrvuses）病毒的测定即病毒的定量分析(一)病毒的物理颗粒计数1.电镜计数，将待测病毒样品与已知数目的聚苯乙烯乳胶颗粒均匀混合后置电镜观察，统计病毒颗粒数目与乳胶颗粒数目，根据两类颗粒数目之比即可计算出待测样品中的病毒颗粒数目。2.血细胞凝集试验血细胞凝集作用（Hemagglution）许多动物病毒的包膜蛋白或外壳蛋白在一定条件下（温度、pH、离子浓度等）能引起体外的一定种类的脊椎动物红血球细胞凝集，此即血细胞凝集作用。血细胞凝集试验由于具有血凝性质的病毒所能凝集血细胞的量与病毒浓度成正比，根据这一原理设计的血细胞凝集试验即可用于病毒定量测定。待测病毒样品2倍稀释（二）病毒的感染性测定（assayofviralinfectivity）*感染性测定测定因感染所引起宿主或细胞培养某一特异性感染反应的病毒数量。*感染单位（infectiousunits,IU）:引起宿主或宿主细胞培养一定特异性反应的病毒最小剂量*效价（title）：单位体积（ml）病毒原液所含的病毒感染单位的数目（IＵ/ml）。1、噬（蚀）斑测定（1）噬菌体的噬菌斑测定，琼脂叠层法（agarlayermethod）一定量的经系列稀释的噬菌体悬液分别与高浓度的敏感细菌，以及半固体营养琼脂均匀混合后，塗布在已铺有较高浓度营养琼脂的平板上，经过孵育培养，在延伸成片的细菌菌苔上出现分散的单个噬菌斑。根据病毒的一次击中（one-hit）动力学性质，一个有感染性的病毒即可引起一个细胞的感染并形成一个噬斑，并且其数目与样品中有感染性的噬菌体颗粒数量成正比，故统计噬斑数目后即可计算出噬菌体悬液效价，并以噬斑形成单位（plagueformingunits，PFU）/毫升（ml）表示。２、动物病毒的蚀斑测定空斑测定转化测定合胞体计数３、植物病毒的环死斑测定半叶法２、终点法（endpointmethod）取等体积的经倍比稀释的病毒系列稀释液分别接种大量同样的试验单元（如实验动物、鸡胚或细胞培养），经过一段时间孵育后，以试验单元群体的半数（50%）个体出现某一感染反应的病毒剂量，来确定病毒样品的效价，称做半数效应剂量，并以50％试验单元出现感染反应的病毒稀释度的倒数的对数值表示。根据试验单元及感染反应的性质分为：半数致死剂量（50%lethaldose,LD50）半数感染剂量（50%infectivedose,ID50）半数组织培养感染剂量（50%tissuecultureinfectivedose,TCID50）终点测定实验记录举例病毒稀释度接种动物数死亡数存活数累积值总死亡数总存活数死亡比例死亡率(%)10-166017017/1710010-266011011/1110010-3642525/77110-4615171/81310-36060130/130根据Reed和Muench方法半数效应剂量(LD50,ID50或TCID50)=50%感染率的高临界稀释度倒数的对数＋距离比×稀释系数的对数．上式中：距离比＝在上例中，距离比＝71-50/71-13=0.36稀释系数为10故LD50=log1/10-3+0.36Xlog10=3.36即该待测样品的LD50效价是10-3.36的低临界感染率的高临界感染率的高临界感染率%50%50%50%50四、病毒的鉴定（一）根据病毒感染宿主的范围及感染表现的鉴定1、病毒感染的宿主范围宿主谱2、病毒感染的症状表现感染宿主机体——疾病症状感染鸡胚——在鸡胚绒毛尿囊膜上形成痘疱（pock）的形态。感染细胞培养——致细胞病变效应表现3、病毒的传播途径与传播媒介（二）病毒的理化性质鉴定1、电镜技术2、分析超速离心技术(三)病毒对理化因子敏感性的鉴定（1）病毒对DNA合成抑制剂的敏感性试验（2）脂溶剂敏感试验（3）耐酸性试验(4)温度敏感试验(5)紫外敏感试验(四)红细胞凝集性质的鉴定不同的具有血凝活性的病毒，其凝集谱、发生凝集反应的条件（温度、pH）都有可能不同,据此可以对病毒进行鉴定。(五)病毒的免疫鉴定免疫沉淀反应，凝集反应，酶联免疫吸附测定，免疫莹光技术，免疫电镜技术、放射免疫技术、单克隆抗体技术等。血凝抑制试验：特异性的病毒抗体与病毒表面有凝集活性的表面蛋白结合，可抑制血细胞凝集反应发生。中和试验：在病毒的中和作用（neutralization）性质上建立，即某些特异性的病毒抗体与病毒作用后，能够使其失去感染性，抑制病毒的繁殖。这类病毒抗体称做中和抗体（neutralizingAbs）。并且一种病毒的感染性只能被其特异性的中和抗体中和，而中和一定量的病毒的感染性必须有一定效价的抗血清。(六)分子生物学方法*变性与不变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳*蛋白质肽图与N末端氨基酸分析*核酸的酶切图谱与寡核苷酸图谱分析*分子杂交*序列测定*聚合酶链反应（PCR）等第三章毒粒的性质第一节描述毒粒性质的结构术语一、毒粒（Virion）1、毒粒是一团能够自主复制的遗传物质（DNA或RNA），它被自身编码的蛋白质外壳所包围，有的还有一层附加膜，以保护其遗传物质免遭环境破坏，并作为将其遗传物质从一个宿主细胞传递给另一个宿主细胞的载体。2、毒粒的基本构成：一个核酸分子（DNA或RNA）蛋白质外壳（由许多相同的蛋白质分子构成）*有的病毒含有多个核酸分子*有的病毒蛋白质外壳由数种不同的蛋白质分子构成*有的病毒蛋白质外壳外还有一层膜结构*有的病毒的多个核酸分子被分别包装在不同的颗粒中3、分段基因组（segmentedgenome）病毒基因组由数个核酸分子构成，只有这些核酸分子同时存在病毒才具有感染性，其各个核酸分子称之为节段（segment）。4、多分体病毒（multicomponentviruses）:具分段基因组的病毒各个核酸节段分别包装在多个颗粒中，只有这些颗粒同时存在病毒才能够复制，个别颗粒感染病毒不能复制，多分体病毒主要见于植物RNA病毒中。二、壳体（capsid），又称衣壳，其同义语是外壳（coat）包围着病毒核酸及其结合蛋白的蛋白质鞘(shell)。三、蛋白质亚基（proteinsubunit），其同义语是原体（protomer）或结构单位（structureunit）以次级键结合构成病毒壳体的蛋白质单体。结构简单的病毒壳体仅由大量相同的蛋白质亚基构成，一些复杂的病毒壳体可能由多种不同的蛋白质亚基构成。四、壳粒（capsomer），又称子粒，其同义语是形态学单位（morphologicalunit）在病毒的二十面体壳体构成中，一定数量的蛋白质亚基以特殊方式聚集形成的，在电镜下可见的结构。蛋白质亚基聚集壳粒聚集二十面体壳体五聚体（pentamer）:由5个蛋白质亚基聚集形成六聚体（hexmer）:由6个蛋白质亚基聚集形成五、核心（core）由病毒核酸及其结合蛋白组成，并被壳体包围的毒粒的中心部分。一些复杂病毒的核心结构较为复杂，这类病毒的核心常称做类核（nucleoid）六、核壳（nucleocapsid），又称衣壳壳体与核心一起构成的复合物，一些简单的病毒的毒