[Ambion]microRNA研究指南[创新技巧]

ContentsmicroRNAs简介及实验概述miRNA定义和生成…………………………………………………………………1miRNA实验概述……………………………………………………………………2microRNA分离和富集miRNA分离mirVana™miRNAIsolationKits…………………………………………..……3“miRNACertified”FirstChoice®TotalRNA……………………………….….3RecoverAll™TotalNucleicAcidIsolationKit…………………………………3TaqManMicroRNACells-to-CTKit……………………………………………7miRNA富集flashPAGE™FractionatorSystem……………………………………………5microRNAs的定量和检测少量靶点的检测TaqManmicroRNAAssay………………………………………………….…..10TaqManMicroRNAAssayEndogenousControls……………………….…..10图谱分析MegaplexRTPrimers…………………………………………………………..10TaqManMicroRNAArrays………………………………………………………10microRNA功能分析Anti-miR™miRNAInhibitors……………………………………………………16Pre-miR™miRNAPrecursorMolecules………………………………………17siPORT™NeoFX™TransfectionAgent………………………………………17pMIR-REPORT™miRNAExpressionReporterVector……………………..18microRNA信息资源参考信息常用细胞系中的miRNA相对表达情况………………………………………...19ABI委托生物通翻译并制作IntroductiontomicroRNAsandExperimentalOverviewmicroRNAs简介一类具有全局调控作用的小分子调控物microRNAs定义microRNAs是一类进化上保守的非编码小分子RNA，具有在翻译水平调控基因表达的功能。尽管第一个microRNA早在1993年被发现，一直到最近几年这类基因的多样性和广泛性才被揭示出来。据推测脊椎动物基因组有多达1000个不同的miRNAs，调控至少30%以上的基因表达。miRNAs有以下特性：9在个体发育过程中起重要作用9在组织中广泛表达，在不同组织中表达不同9参与病毒感染过程9和原癌基因有关microRNA的生成：在细胞核内，基因组DNA转录生成较长的RNA分子（可长达1000nt），被双链RNA特异的核糖核酸酶Drosha切割成长度大约70-100碱基的、具发夹结构的RNA分子（前体microRNA）。这些发夹结构的RNA通过核输出蛋白exportin5机制转运到细胞质，然后被第二个双链RNA特异的核糖核酸酶Dicer切割，得到19-23nt大小的成熟的miRNAs产物。成熟的单链miRNAs与类似RNA诱导沉默复合物(RISC)结合，并参与RNA干扰反应(RNAi)。在动物中，结合在复合物上的miRNA以一种目前尚未完全清楚的机制结合到序列基本互补(并非完全互补)的mRNA上----但这种结合往往不像RNAi反应那样参与mRNA降解----而是阻止所结合的mRNA的翻译，导致相应基因表达水平的下降。大约60%的miRNAs为独立表达，15%左右的miRNAs成簇表达，还有25%的miRNAs位于内含子。IntroductiontomicroRNAsandExperimentalOverviewmiRNA实验概述作为一类独特的小分子RNA，要准确和灵敏地分析miRNAs需要专门的研究工具。AB与Ambion的科学家开发了一系列产品，为此类基因的准确鉴别和分类提供完整的解决方案。这些工具将帮助研究人员揭开miRNA和蛋白表达之间的关系，有助于发掘新的诊断和治疗靶标。分离与富集分析miRNAs的第一步就是从生物样品中纯化miRNAs。多数RNA分离试剂盒都是为mRNA回收而设计的，通常会弃去较小的RNA分子如miRNAs。mirVana™miRNA分离试剂盒特别为分离包括小于200碱基的小分子RNA在内的所有RNA分子而设计，flashPAGE™Fractionator可用于分离包括成熟miRNA在内的10-40碱基大小的RNA小分子。产品系列•mirVana™miRNAIsolationKit•mirVana™PARIS™Kit•RecoverAll™TotalNucleicAcidIsolationKitforFFPE•flashPAGE™Fractionator•TaqManmicroRNACelltoCtKit新“miRNACertified”FirstChoice®TotalRNA检测与定量基于定量PCR方法的检测与定量通过对分析方法的创新改造，美国应用生物系统公司将TaqMan分析和实时定量PCR的特异性、灵敏度和重复性的金标准引入了miRNA的检测和定量。单个的MicroRNAAssays适合特定的miRNA定量流程，而新的MegaplexPrimerPools则是人、小鼠和大鼠的完整图谱研究的理想选择。产品系列少量靶点的检测·TaqManmicroRNAAssay·TaqManMicroRNAAssayEndogenousControls图谱分析·MegaplexRTPrimers新·TaqManMicroRNAArrays新功能分析miRNA功能分析可以用类似普通基因的分析方法进行。上调miRNAs的表达可用于鉴别“功能获得”的表型，下调或者抑制miRNAs则可以用于鉴别功能缺失的表型。结合上调或者下调miRNAs可用于鉴别调控特定miRNAs的基因，以及用于鉴别特定miRNAs参与的细胞进程。产品系列Pre-miR™miRNAPrecursorMolecules•Anti-miR™miRNAInhibitors•siPORT™NeoFX™TransfectionAgent•pMIR-REPORT™miRNAExpressionReporterVector全基因组的microRNA发现应用生物系统公司的新一代测序仪SOLiD,以其高通量、准确的序列测定技术，为从整个基因组水平研究microRNA提供了可靠的平台。（相关资料欢迎索取）第页microRNAIsolationandEnrichmentmiRNA分离Ambion专门为miRNA和其他小分子RNA的制备而开发了试剂盒----mirVana™RNA分离试剂盒。不同于传统的RNA分离产品，mirVana能定量的回收小于200碱基的小分子RNA，避免实验偏差，保持小分子RNA代表性。良好的开始是成功的一半小分子RNA分析的第一个关键步骤就是从生物样本中纯化小分子RNAs。多数传统RNA分离试剂盒目的是为回收mRNA而设计的，往往会弃去较小的RNA分子以减少干扰提高mRNA得率。因此这些步骤会导致一些小分子RNAs如miRNAs的损失。多数RNA纯化试剂盒采用的标准玻璃纤维滤膜或者硅胶滤膜，不能有效的回收小分子RNA。从图5可以看出，GFF行（5A和5B）尽管能有效回收5.8SrRNA，但其他小分子RNA如U1snRNA,5SrRNA,tRNA,和各种miRNAs部分或者全部被弃除。mirVana™miRNAIsolationKitsmirVana™miRNAIsolationKit采用改良的玻璃纤维滤膜方法来快速回收细胞或者组织样品中全部RNA分子，包括小分子RNA。mirVana™PARIS™Kit更进一步，除了回收包含小分子RNA在内的全部RNA，还可以用于回收样品中的蛋白质。Ambion的miRNA分离产品保证有效定量地回收各种小分子RNA，以供后继实验顺利进行。“miRNACertified”FirstChoice®TotalRNA如果实验计划采用已经纯化的商品化RNA用于miRNA分析，那么这些RNA的纯化方法也是一个重要的考虑因素，因为如果这些RNA是用常规玻璃纤维膜制备的，那么很可能缺失了部分甚至全部小分子RNA组分。Ambion提供来自人类，小鼠和大鼠的“miRNACertified”FirstChoice®TotalRNA，已经验证包含miRNAs在内的小分子RNAs。RecoverAll™TotalNucleicAcidIsolationKitAmbion新推出专利的RecoverAll™TotalNucleicAcidIsolationKit是专门为福尔马林固定石蜡包埋样本的RNA和DNA提取而设计的，提取的核酸包括了FFPE样品中的全部miRNAs，配flashPAGE™Fractionator系统和mirVana™miRNAArray可用于miRNA表达图谱分析。Figure6.mirVana™miRNAIsolationKitforEfficientRecoveryofmiRNA.(A)TotalRNAwasisolatedfromthesamemouseliverlysateusingadoublephenol/guanidiniumextraction(DPGE)orthemirVanamiRNAIsolationKitprocedureintriplicate(miRNA1to3).Theexperimentwasperformedwithtwodifferentmouseliverlysates.EachsampleRNA(1μg)wasanalyzedonadenaturing15%polyacrylamidegelstainedwithethidiumbromide.(B)RNAsfromthesamegelweretransferredtoamembraneandprobedforU2snRNAandlet-7miRNA.TherelativeamountofsmallRNAineachlanewasquantifiedwithaphosphorimager.ThegraphshowsthepercentageofrecoverywithrespecttotheDPGEprep.第页microRNAIsolationandEnrichment表1，小RNA分离与富集产品选择指南分离样本产品主要优点小分子RNA总RNA蛋白mirVana™miRNAIsolationKit简单地从培养细胞和大多数组织（包括核糖酶丰富的组织）中分离小分子RNA●●mirVana™PARIS™Kit快速简单的从培养细胞和多数组织样本中分离小分子RNA和蛋白质●●●miRNACertifiedîFirstChoice®TotalRNA即用型高质量RNA，有源自人类、小鼠和大鼠多种组织以及人类培养细胞系可供选择●●RecoverAll™TotalNucleicAcidIsolationKitforFFPE专门为从FFPE组织中分离包括miRNAs在内的总核酸而设计●●Figure5.DifferentialRecoveryofSmallRNAs.(A)TotalRNAwasisolatedfrom1x106HeLacellsusingthreedifferenttechniques:monophasicphenol/chaotropicextraction(MPCE),bindingonglassfiberfilteringuanidiniumsolution(GFF)ordoublephenol/guanidiniumextraction(DPGE).PurifiedRNA(1μg)wasresolvedona1.2%denaturingagarosegel(topleftpanel)or