基因工程药物的质量控制

浅议基因工程药物的质量控制国药集团长春生物制品研究所有限公司长春金赛药业有限公司哈药集团生物工程有限公司生命科学正成为21世纪的领头科学。生物药物毒性低、副作用小、容易为人体吸收，因此在药品中比例趋增。自1982年全世界第一个基因重组新药“人胰岛素”在美国上市以来，美国现已有近百种基因工程重组生物技术药物获FDA批准上市；自1989年我国批准了第一个在我国生产的基因工程药物重组人干扰素α1b，现已正式批准上市的达20种。《中国药典》（2000年版）首次载入了基因工程产品。目前，基因工程药物主要有重组蛋白质或多肽类、抗体和疫苗3大类。此类药物的出现和发展，给药物分析带来了新的挑战，由于其可能含有用传统生产方法不可能存在的有害物质，所以这类产品的质量控制与传统方法生产的产品有本质的差别。鉴于这类产品生产工艺的特殊性，除需要鉴定昀终产品外，还需从基因的来源及确证、菌种的鉴定、原始细胞库等方面提出质量控制的要求，对培养、纯化等每个生产环节严格控制，才能保证昀终产品的有效性、安全性和一致性。由于产品有其固定的易变性，质量控制尚无非常成熟的经验和方法，本文在此就有关问题作一简述。1质量控制要点1.1原材料主要是对目的基因、表达载体及宿主细胞（如细菌、酵母、哺乳细胞和昆虫细胞）的检查，以及使用它们时制订严格要求，否则就无从保证产品质量的安全性和一致性，并可能产生不希望产生的遗传诱导的变化。1.2培养过程无论是发酵还是细胞生产，关键是保证基因的稳定性、一致性和不被污染。主要控制的有生产用细胞库、有限代次的生产、连续培养过程。1.3纯化工艺过程要求能保证去除微量DNA、糖类、残余宿主蛋白质、纯化过程带入的有害化学物质、致热原，或者将这类杂质减少至允许量。1.4昀终产品主要表现在生物学效价测定、蛋白质纯度检查、蛋白质的比活性、蛋白质的性质鉴定几个方面。1.5杂质检测蛋白类，由于降解、聚合或者错误折叠而造成的目的蛋白变构体在体内往往会导致抗体的产生；非蛋白类，主要有细菌、病毒、热原质和DNA几种类型，往往在极低的水平就可以产生严重的危害作用。1.6安全性试验其中的无菌试验、热原试验、安全性和毒性试验按我国新颁布的《中国生物制品规程》进行。2基因工程药物的检验基因工程药物的质量控制需要采用理化、免疫学及生物学的方法共同实现。目前在基因工程药物的质量控制中，理化测定代替生物测定成为趋势，生物测定已退居为产品批准上市前做基础研究的生物活性验证手段。下面为成品理化性质的检定。2.1蛋白质含量通常是测定溶液中蛋白质的浓度，由于每一种蛋白质都含有恒定量的氮元素，因此可以通过测定样品蛋白质中的氮含量来对蛋白质定量。常用的方法有光吸收法、双缩脲法、福林-酚法等。2.2蛋白质纯度是一个重要的指标。一般指是否含有其他杂蛋白，而不包括盐、缓冲液离子、十二烷基硫酸钠（SDS）等小分子在内，根据中国生物制品检定规程，要求考虑上述小分子的存在与否。常用的方法有聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、等电聚焦（IEF）、毛细管电泳（HPCE）、高效液相色谱（HPLC）等。2.3蛋白质的分子量测定常用的方法有SDS-PAGE、HPCE、质谱法等。2.4蛋白质等电点的测定理论上，一种蛋白质只有一个等电点。常用的方法有IEF法等。2.5氨基酸组成分析可以和标准样品进行比较，以确认重组蛋白质的氨基酸组成是否和天然的蛋白质的氨基酸组成一样，如果是未知蛋白质，可以到蛋白质数据库中查阅，看和哪一种已知蛋白质组成相同，再做进一步确认，或者可能是一种新的蛋白质。常用的方法有水解蛋白质或多肽、氨基酸衍生方法（茚三酮法、荧光胺法等）等。2.6部分氨基酸序列分析首先将氨基酸一个一个依次从蛋白质或者多肽的末端（N端或C端）切割下来，有化学法和酶法（化学法用得较多）；然后在氨基酸残基上衍生一个生色集团，通过HPLC法进行分离测定。包括N端氨基酸分析和C端氨基酸分析。2.7肽图分析根据蛋白质分子量大小以及氨基酸组成特点，使用专一性较强的蛋白水解酶作用于特殊的肽链位点，将蛋白质裂解成较小的片断，通过一定的分离检测手段形成特征性的指纹图谱来进行分析。3方法及技术应用大都采用适合于肽、蛋白质、多糖等大分子化合物的现代色谱、光谱综合性方法。3.1质谱分析质谱技术（MS）包括MS联用广泛应用于蛋白质的纯度鉴定、分子量测定、序列测定、肽谱分析、二硫键测定、乙酰、糖基化等研究中，前景广阔。MS可以测定一个未知蛋白质或者不纯蛋白质各个组分的分子量（可高达几十万甚至几百万），同时可以定出较复杂的蛋白质裂解的每个肽片段的分子量及其序列；可以解决一些用经典的蛋白质结构测定方法难以解决的问题，如N端封闭的肽和环肽样品。常用的有快原子轰击质谱技术（FAB）、电喷雾质谱技术（ESI）、基质辅助激光解析质谱技术（MALDI）等。3.2核磁共振技术（NMR）近来出现了二维、三维乃至四维NMR技术，提供了生物大分子的三维结构信息、局部结构以及构象动力学方面的信息；NMR技术还可以应用到鉴定蛋白质分子中某些原子与配体中某些原子间的相互接触，研究大分子间以及它们与小分子之间相互作用和分子识别。大致步骤为：研究样品的选择和制备、NMR数据的采集与数据处理、质子自旋系统的识别与信号归属、决定结构约束因子和分析规则二级结构、计算出符合约束因子的三维结构和进行结构精修。3.3双相电泳技术双相凝胶电泳即等电聚焦/十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（INF/SDS-PAGE），分离系统应用了蛋白质分子的两个特性对其进行分离，第一相是根据不同蛋白质分子所带电荷量的差异，用等电聚焦技术分离蛋白质；第二相是根据不同蛋白质分子量大小的不同，与SDS结合后在聚丙烯酰胺凝胶中迁移的速度不同达到分离蛋白质的目的。随着技术的不断改进，结合同位素标记技术灵敏度逐渐提高，其应用范围更加广泛。3.4蛋白质的二硫键分析二硫键是否正确配对，对生物活性至关重要。方法有前述的MS法。4临床前安全性评价指导原则适用于利用细菌、酵母、昆虫、植物和哺乳动物细胞等表达系统从特征性细胞中得到的药物，但不包括常规细胞细菌和病毒疫苗或细胞和基因治疗。在设计方案时应考虑：相关动物种属的选择；动物的数量；给药方案；免疫原性；使用过程中受试动物的稳定性和量的恒定。要求包括：安全药理学；暴露水平评价（药代和毒代动力学）；单次给药毒性研究和重复给药毒性评价；免疫毒性研究；生殖和发育毒性研究；遗传毒性研究；致癌毒性研究；局部耐受性研究等8个方面。每一种生物技术药品是独特的，因此应根据药品的具体情况制定不同的安全性评价方案。生物技术药品的不良反应是其药理作用的放大，应选择昀为相关的动物对其进行临床前安全性评价，再结合其生物学活性、药效和药代的资料，就能得到有用的药品安全性信息。20年来，我国虽然对生物技术药物分析研究做了大量的基础性工作，但仍有许多新问题、新情况需要认真对待，以适应时代变革的要求。我国生物药物分析的整体水平与发达国家相比，发展还极不平衡，更为先进的分析化学技术还不能及时地应用于生物药物的分析领域；对新兴生物技术药物的有效质量控制体系还未形成；相关的基础性研究还处于起步阶段，已滞后于生物技术药物本身的发展水平。这些都是亟待我们发展和努力的。