植物体内氧自由基含量测定

实验四十六植物体内氧自由基含量的测定一、目的生物体内的一部分氧分子，在参与酶促或非酶促反应时，若只接受一个电子，会转变为超氧阴离子自由基（O2－）。O2－既能与体内的蛋白质和核酸等活性物质直接作用，又能衍生为H2O2羟自由基（·OH）、单线态氧（1O2）等。·OH可以引发不饱和脂肪酸脂质（RH）过氧化反应，产生一系列自由基，如：脂质自由基（·R）、脂氧自由基（RO·）、脂过氧自由基（ROO·）和脂过氧化物（ROOH），自由基积累过多时会对细胞膜及许多生物大分子产生破坏作用。本实验主要掌握植物体内氧自由基的测定原理及方法。二、原理在生物体中，氧作为电子传递的受体，得到单电子时，生成超氧阴离子自由基（O2－）。利用羟胺氧化的方法可以测定生物系统中O2－含量。O2－与羟胺反应生成NO2－，NO2－在对氨基苯磺酸和α－萘胺的作用下，生成粉红色的偶氮染料（对－苯磺酸－偶氮－α－萘胺）。取生成物在530nm波长处测定吸光度（A）值，根据A530值可以算出样品中O2－含量。反应式如下：NH2OH+2O2－＋H＋→NO2－＋H2O2＋H2O三、材料、仪器设备及试剂1.材料：花生、绿豆、大豆黄化幼苗的下胚轴及其他植物叶片。2.仪器设备：高速冷冻离心机；分光光度计；恒温水浴锅；研钵；试管；移液管；试管架；移液管架；洗耳球等。3.试剂配制：50mmol·L－1磷酸缓冲液（pH7.8）1mmol·L－1盐酸羟胺17mmol·L－1对氨基苯磺酸（以冰醋酸：水=3：1配制）7mmol·L－1α－萘胺（以冰醋酸：水=3：1配制）50nmol·ml－1NaNO2母液四、实验步骤1.提取液制备称取1g植物叶片放入冰浴的研钵中，加入50mmol·L－1磷酸缓冲液（pH7.8）5ml,研磨成匀浆，在1000r/min，4℃下离心10min，取上清液再以15000r/min，4℃下离心20min，第二次上清液即为样品提取液。2.亚硝酸根标准曲线的制作2.1系列浓度NaNO2溶液的配制取50nmol·ml－1NaNO2母液，分别稀释成0、10、20、30、40和50、nmol·ml－1的标准稀释液。2.2取7支试管，编0～6号，分别加10、20、30、40、50、nmol·ml－1NaNO2标准稀释液1ml，0号管加蒸馏水1ml，然后各管再加50mmol·L－1磷酸缓冲液1ml，17mmol·L－1对氨基苯磺酸1ml和7mmol·L－1α－萘胺1ml，置于25℃显色20min后，以0号管作空白对照，在530nm波长处测定吸光度（A）值。2.3标准曲线绘制以1～6号管亚硝酸根（NO2－）浓度为横坐标，吸光度值作纵坐标，绘制标准曲线。3.O2－含量测定取4支试管，编0～3号，1～号管分别加入样品提取液0.5ml（三个重复），0号管加蒸馏水0.5ml，然后各管加入50mmol·L－1磷酸缓冲液0.5ml，1mmol·L－1盐酸羟胺1ml，混匀，置于25℃1h后，各管再加入17mmol·L－1对氨基苯磺酸1ml和7mmol·L－1α－萘胺1ml，混匀，置于25℃显色20min，以0号管为空白对照，在530nm波长处测定吸光度（A）值。五、结果计算根据所测得的A530值，从标准曲线上查得样品中NO2－浓度，按公式（1）即可计算出样品中NO2－浓度。然后依据羟胺与O2－的上述反应，从NO2－对O2－进行化学计量，按公式（2）计算，即将按公式（1）计算得到的NO2－浓度乘2，得O2－浓度。也可根据被测样品与羟胺反应的时间和样品中蛋白质含量，按公式（3）求得O2－的生产率。从标准曲线查得NO2－（nmol）×提取液总量（ml）NO2－含量（nmol·g－1Fw）=——————————————————————…（1）样品重（g）×测定时提取液用量（ml）将所得NO2－含量代入下式计算，即求出O2－含量。O2－含量=NO2－（nmol·g－1Fw）×2………………………………………………（2）将公式（2）所得的O2－浓度及样品中蛋白质含量，依下式计算出O2－产生速率。O2－（nmol）O2－产生速率（nmol·mg－1蛋白·min－1）=———————————————…（3）蛋白质（mg）×反应时间（min）六、注意事项如果样品中含有大量叶绿素将干扰测定，可在样品液与羟胺温浴后，加入等体积乙醚提取叶绿素